Сравнительный анализ электрофоретических спектров белков семян Fagopyrum cymosum Meisn. и F. tataricum Gaertn

зародышей. Результатом скрещивания F. tataricum с F. cymosum на тетраплоидном уровне стало получение искусственного вида F. giganteum Krotov [1]. Фертильные гибриды на диплоидном уровне, а также гибриды F. giganteum с обоими родительскими видами также были получены без использования биотехнологических методов [2-4]. Гибридизация этих видов с F. esculentum возможна только посредством культивирования незрелых зародышей, причем полученные межвидовые гибриды стерильны [5]. Данные о большей филогенетической близости F. tataricum и F. cymosum, чем между этими видами и F. esculentum были получены также в результате анализа хлоропластной ДНК [6].

Анализом полиморфизма нуклеотидных последовательностей фрагментов хлоропластной ДНК F. tataricum и F. cymosum установлено , что F. cymosum делится на 3 эволюционные ветви . Одна из них включает популяции из провинций Сычуань и Юньнань , вторая – популяции из Индии , и третья – из Тибета . У F .tataricum полиморфизм по этим генам не выявлен , этот вид входит в тибетскую ветвь F. cymosum [7].

Анализ полиморфизма F. tataricum по белкам семян подтверждает вывод о монофилетическом происхождении этого вида . Изменчивость по белкам семян мировой коллекции F. tataricum ограничена наличием / отсутствием одной интенсивной полосы [8]. Эта полоса присутствовала в спектрах некоторых образцов из Ю - В Азии .

Цели настоящей работы – электрофоретический анализ по белкам семян образцов F. cymosum, поддерживаемых в коллекции ВНИИЗБК, и сопоставление полученных спектров со спектром F. tataricum; анализ спектра белков семян искусственного амфидиплоида F. giganteum (константный межвидовой гибрид F. tataricum × F. cymosum).

Материал и методы

В опыте использовали стандартный арбитражный метод ISTA для выделения и электрофоретического разделения белков семян двудольных [9, 10], адаптированный для гречихи в лаборатории биохимии ВНИИЗБК . Белки экстрагировали из муки в течение 20 часов при температуре 3-4º С с помощью электродного буфера (Tris, глицин , DS-Na): рН =8,3. После центрифугирования 10 мкл экстракта переносили в ячейку планшетки , где смешивали с равным объемом буфера нанесения (DS-Na, Tris- Н Cl, глицерин , меркаптоэтанол , бромфеноловый синий ). Концентрация разделяющего геля – 10 %, концентрирующего – 5 %.

Для характеристики спектров по компонентному составу проводили анализ 28-36 семян каждого образца индивидуально . Спектры всех образцов дополнительно сравнивались между собой , а также со спектрами линий к -17 ( или к -108) F. tataricum в пределах одного геля . Интенсивность компонентов спектра оценивали как : 1 – слабый , 2 – интенсивный и 3 – очень интенсивный . Относительную подвижность полипептидов анализировали по « соевой » шкале [9].

• F. cymosum представлен в работе тремя образцами : одним тетраплоидным (2n=32) из Индии ( образец коллекции ВИР к -4231) и двумя диплоидными из Юго - Восточного Китая ( провинция Сычуань ) 68

( образцы коллекции университета Киото С 9057 и С 9143). Несмотря на отсутствие образцов из некоторых других регионов распространения этого вида , можно составить определенное представление о его изменчивости , а также об уровне межвидовых различий .

Результаты и обсуждение

Спектры диплоидных образцов С 9057 и С 9143 идентичны . Между диплоидными и тетраплоидным образцами выявлены различия . В спектре тетраплоидного образца к -4231 из 52 компонентов 44 имеют аналоги ( по подвижности и интенсивности ) в спектрах диплоидных образцов , среди них девять очень интенсивные и двенадцать интенсивные . Еще 3 компонента идентичны по подвижности , но различаются по интенсивности .

В спектре к -4231 обнаружено три « дополнительных » ( отсутствующих в спектрах диплоидных образцов F. cymosum ) интенсивных компонента : один – в диапазоне 45-65 kDa, и два – в диапазоне 25-45 kDa. Кроме того , в спектре к -4231 найден компонент с интенсивностью 1, не встречающийся в спектрах диплоидов . В спектрах С 9057 и С 9143 выявлено два интенсивных и один очень интенсивный компонент с молекулярной массой менее 25 kDa, которые не обнаружены в спектре тетраплоида ( табл . 1, 2).

Таблица 1 – Распределение компонентов спектра, «уникальных» и не различающихся по интенсивности между образцами

В спектре к-4231 из 52 компонентов 39 имеют аналоги в спектре F. tataricum, среди них 31 идентичны по интенсивности. В спектре С9143 из 50 компонентов 37 имеют аналоги в спектре F. tataricum, среди них 29 идентичны по интенсивности. В суммарном спектре F. cymosum (k-4231 + C9143) обнаружено 13 полос, отсутствующих у F. tataricum, из которых 12 присутствуют в спектрах обоих образцов F. cymosum. Таким образом, выявлено всего 2 позиции (87 и 107), полиморфные как на межвидовом уровне, так и на внутривидовом (в пределах F. cymosum). Одна из них (87) – единственная полиморфная позиция в рамках изменчивости F. tataricum [8].

Таблица 2 – Компоненты, различающиеся по интенсивности в спектрах разных образцов

Анализ спектра константного межвидового гибрида F. tataricum ( к -108, 4 х =32) × F. cymosum ( к 4231), аналогичного по геномному составу искусственному амфидиплоиду F. giganteum Krotov, подтвердил предположение о кодоминантном наследовании компонентов спектров родительских видов , хотя интенсивность ряда компонентов была ниже , чем у исходных форм . Возможно , это связано с увеличением числа компонентов белкового комплекса и пропорциональным уменьшением доли каждого из них .

Время самостоятельного существования F. tataricum и F. cymosum составляет около 1,8 миллиона лет ( для сравнения был взят оказавшийся наиболее близким к F. tataricum образец F. cymosum из Тибета ) [7]. Виды сильно дивергировали по ряду признаков . В частности , произошел переход от многолетнего образа жизни , характерного для F. cymosum , к однолетнему , а также переход от перекрестного опыления , ассоциированного с гетероморфной системой несовместимости , к самоопылению на основе гомостилии , связанный с потерей доминантного аллеля локуса гетеростилии [11, 12].

В то же время на примере этих двух видов мы наблюдаем высокий консерватизм генетической системы , контролирующей синтез белков семян . В этой системе закрепилась всего одна мутация , выявляемая использованным методом электрофореза , за все время существования вида F. tataricum . Спектры образцов F. cymosum сходны по 47 позициям , из которых 44 не различаются по интенсивности . В каждом из них обнаружены компоненты , которые имеют аналоги по подвижности и , иногда , интенсивности в спектре F. tataricum , и не имеют аналогов в спектре другого образца F. cymosum . Выявлено всего 5 компонентов , присутствующих только в спектре F. tataricum , и по одной « уникальной » полосе в спектрах каждого из образцов F. cymosum .

Таким образом , учитывая вероятно высокую эволюционную консервативность каждого компонента спектра , на примере этих двух видов мы наблюдаем последствия видообразования как результата распада популяции предковой формы на несколько частей в дальнейшем эволюционировавших независимо . По данным , представленным в этой работе , а также по результатам анализа некоторых последовательностей хлоропластной ДНК [7] можно сказать , что татарская гречиха представляет собой одну из таких частей . F. cymosum , по результатам нашей работы , представлен как минимум двумя эволюционными линиями .

Объединение в одном генотипе геномов этих видов , с которым мы имеем дело на примере синтетического амфидиплоида F. giganteum , также не нарушает синтез полипептидов , как характерных для обоих видов , так и для каждого в отдельности . Это , вероятно , свидетельствует об отсутствии существенной дивергенции регуляторов , обеспечивающих координацию синтеза белков семян .

Таким образом , электрофоретическая подвижность компонентов спектра белков семян в роде Fagopyrum – эволюционно достаточно консервативный признак . Это позволяет рассматривать белковый « штрих код » как эффективный инструмент для прослеживания достаточно далеких эволюционных событий , возможно связанных с видообразованием .