Сравнительный анализ эпигенетических и белковых маркеров в крови больных немелкоклеточным раком легкого

Рак легких (РЛ) занимает одно из ведущих мест в структуре общей летальности от онкологических заболеваний у мужчин, поскольку зачастую диагностируется на поздних стадиях. Известно, что своевременное выявление РЛ существенно повышает эффективность лечения. Так, 5-летняя выживаемость радикально пролеченных больных РЛ I стадии достигает 70 %, III стадии – 15 % [20] . Используемые в настоящее время методы диагностики РЛ малоэффективны для обнаружения опухоли до ее клинической манифестации. Белковые онкомаркеры (РЭА, CYFRA 21.1 и др.), детектируемые в сыворотке/плазме крови при помощи иммуноферментного анализа, несмотря на относительно высокую специфичность (до 97 %), не обладают достаточной чувствительностью – не более 60 % [8], что ограничивает их использование для ранней диагностики РЛ. Эти маркеры используются в основном для оценки эффективности лечения, мониторинга течения заболевания и для раннего выявления рецидива опухоли у больных, у которых отмечалось повышение уровня маркеров до лечения: до 70–87 % – для CYFRA 21.1 и до 58–65 % – для РЭА. Таким образом, поиск новых маркеров, пригодных для ранней диагностики РЛ, которые бы позволяли выявлять заболевание с более высокой чувствительностью. является актуальной задачей. В качестве таких маркеров наиболее перспективным представляется использование патогенетически значимых молекулярно-генетических маркеров, которые могут быть обнаружены в циркулирующей крови. Действительно, ДНК трансформированных (опухолевых) клеток обнаруживаются во внеклеточных ДНК, циркулирующих в плазме крови (цирДНК плазмы) [1], и могут быть использованы для малоинвазивной диагностики опухолей. В последние годы наблюдается экспоненциальный рост количества исследований, посвященных поиску онкомаркеров в составе свободно циркулирующих ДНК крови, которые могут быть использованы для диагностики злокачественных новообразований на ранних стадиях [12, 14, 21, 22].

Известно, что цирДНК не только свободно циркулируют в плазме крови, но и могут быть адсорбированы на поверхности форменных элементов крови [17, 22], при этом в составе цирДНК, связанных с клеточной поверхностью (скп-цирДНК), так же как и в ДНК плазмы, присутствуют ДНК-маркеры, характерные для клеток опухолей [2, 10, 15, 16]. Важную роль в возникновении и прогрессии злокачественных опухолей, наряду с генетическими повреждениями, играют эпигенетические изменения, которые возникают вследствие нарушения процессов метилирования ДНК и приводят к изменению экспрессии генов, вовлеченных в регуляцию ключевых биологических процессов в клетке [1]. Использование аберрантно метилированных форм генов в качестве онкомаркеров представляется особенно перспективным, поскольку метилирование генов опухолевой супрессии характерно практически для всех типов опухолей, наблюдается уже на ранних стадиях злокачественной трансформации клеток, а аберрантно метилированная ДНК может быть легко выявлена в присутствии большого избытка неметилированной формы [1, 4, 18]. Показано, что метилированные формы генов RARβ2, RASSF1A, p16, FHIT, APC могут рассматриваться в качестве потенциальных онкомаркеров РЛ [20].

Целью исследования явились сравнительный анализ эпигенетических маркеров (метилированные формы RARβ2 и RASSF1А) в составе цирДНК крови и белковых онкомаркеров плазмы крови (РЭА и CYFRA 21.1) у больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) и оценка чувствительности и специфичности диагностики опухолевого процесса, основанного на измерении концентрации этих маркеров.

Материал и методы

В исследование включено 55 больных НМРЛ T1–3N0–3M0, с морфологически верифицированным диагнозом, в возрасте 40–70 лет, находившихся на лечении в клинике НИИ онкологии СО РАМН с 2006 по 2009 г. Все больные получали комбинированное лечение, включавшее 2 курса неоадъювантной химиотерапии по схеме паклитаксел + карбоплатин с последующим хирургическим вмешательством с интраоперационной лучевой терапией. Материалом для исследования служила венозная кровь, которую забирали до лечения. В качестве контроля была сформирована выборка из 32 практически здоровых мужчин (возрастной интервал – 35–60 лет, без онкологических заболеваний в анамнезе), проживающих на территории Западно-Сибирского региона. Все исследования проведены в соответствии с международными этическими правилами, получено разрешение этического комитета НИИ онкологии СО РАМН.

Венозную кровь собирали в 0,05 М раствор ЭДТА в фосфатно-солевом буфере (соотношение крови и ЭДТА 1:5). Образцы крови разделяли на плазму и клетки крови, фракцию цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, получали последовательной обработкой клеток 5мМ фосфатным буфером и 0,125 % раствором трипсина, как описано ранее [19].

ДНК выделяли из 1 мл плазмы, 6 мл ФБ-ЭДТА и 2 мл трипсиновой фракции с помощью наборов «Blood DNA Isolation Kit» фирмы «Bio-Silica Ltd.» (Новосибирск, Россия). Образцы ДНК модифицировали бисульфитом натрия, очищали с помощью наборов для выделения модифицированной ДНК «Bisulfite ssDNA Isolation Kit» фирмы «BioSilica Ltd.». Концентрацию метилированных и неметилированных форм генов опухолевой супрессии RASSF1A и RARβ2 в циркулирующих ДНК крови определяли с использованием количественной метилспецифичной ПЦР (МС-ПЦР) [5, 16]. Индекс метилирования вычисляли по формуле M (%) = 100 × (число метилированых копий гена/(число метилированнных копий + число неметилированных копий) для цирДНК плазмы и скп-цирДНК. Концентрацию белковых маркеров в плазме крови исследовали иммунофер-ментным анализом при помощи коммерческих наборов: РЭА (Вектор-Бест, Россия), CYFRA 21.1. (DRG Enzyme Immunoassay Kit, Германия) – согласно инструкциям от производителя. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0». Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение и среднюю квадратичную ошибку. Статистическую значимость различий определяли с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни. Чувствительность и специфичность маркеров оценивались с помощью ROC-анализа (MedCalc software, Broekstraat 52, 9030 Mariakerke, Belgium).

Результаты и обсуждение

Гиперметилирование генов RASSF1A и RAR β 2 выявляется с высокой чувствительностью – 45–60 % и 39–50 % соответственно в клетках НМРЛ [3, 7, 9, 11]. При этом чувствительность, с которой метилированные последовательности этих генов детектируются в составе циркДНК плазмы крови больных раком, ниже по сравнению с образцами опухолевой ткани и варьирует в зависимости от используемого метода детекции (37–54 % – для гена RAR β 2 и 12–39 % – для гена RASSF1A) [6, 9].

Для того чтобы повысить чувствительность детекции метилированных форм генов опухолевой супрессии генов RASSF1A и RAR β 2 при РЛ, при помощи количественной МС-ПЦР были определены концентрации метилированных и неметилированных форм исследуемых генов в цирДНК плазмы крови и в скп-цирДНК. На основании полученных данных был рассчитан индекс метилирования каждого гена. Выявлено статистически значимое повышение индекса метилирования генов RASSF1A, RARβ2 в цирДНК плазмы и в скп-цирДНК у больных НМРЛ по сравнению со здоровыми донорами (табл. 1).

По данным ROC-анализа чувствительность и специфичность выявления рака легкого при определении метилирования гена RARβ2 в суммарных цирДНК (цирДНК плазмы и скп-цирДНК) составила 79 % и 70 % (для выбранного оптимального порогового значения индекса метилирования – 33 %), а гена RASS-F1A – 83 % и 74 % (при пороговом значении индекса метилирования – 31 %). Полученные данные демонстрируют, что определение маркеров в суммарных цирДНК, чувствительность выявления метилированных форм исследуемых генов сопоставимо с чувствительностью детекции этих маркеров в образцах опухолевой ткани. Одновременная оценка индекса метили-

Таблица 1

Индекс метилирования генов RASSF1A и RARβ2 в цирДНК крови у больных НМРЛ с разными гистологическими формами и стадиями заболевания

Превышение порогового уровня белковых маркеров в крови больных с разными гистологическими формами и стадиями заболевания