Сравнительный анализ морфологии клеток крови и ее биохимических особенностей у кроликов при хроническом описторхозе

Kuvshinov DYu, Sidelnikova AA. The comparative analysis of blood cell morphology and its biochemical features in rabbits with chronic opisthorchiasis. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2022;30(3):603. (3).603

Введение. Описторхоз, являясь системной патологией, оказывает патогенное воздействие как в месте инвазии, так и в других органах и системах [1]. Изменения наблюдаются и в системе крови. Существует множество предпосылок для изменения эритро- и лейкопоэза, изменения биохимических параметров крови, системы гемостатаза в условиях опи-сторхозной инвазии. В частности, при описторхозе у человека фиксируются повышение содержания аспартатаминотрансферазы (далее - АСТ) и аланинаминотрансферазы (далее - АЛТ), билирубина, холестерина, в хронической фазе АЛТ у мужчин возвращается к норме [2]. При изучении общего анализа крови в острой фазе описторхоза отмечены снижение количества эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитоз с ростом числа базофилов и нейтрофилов [3]. Морфологические изменения форменных элементов крови животных при остром описторхозе проявлялись в виде гиперсегментации ядер, дегрануляции цитоплазмы зернистых лейкоцитов, появлением вакуолей в лимфоцитах [4]. Биохимический анализ крови в хроническую фазу через 1,5 года выявил увеличение содержания мышечной креатинкиназы (далее - КФК-МВ), лактатдегидрогеназы (далее - ЛДГ), количество мочевой кислоты, АСТ, АЛТ находится в пределах нормы, но коэффициент соотношения АСТ/АЛТ был повышен [5]. Морфологических исследований элементов крови при описторхозе у кроликов в эти сроки не проводилось, в связи с чем характер взаимосвязей биохимических и морфологических параметров крови при описторхозе требует дальнейшего уточнения.

Цель исследования: сравнительный анализ и сопоставление морфологических и биохимических изменений в крови при хроническом описторхозе на экспериментальной модели животных Oryctolagus cuniculus.

Материалы и методы исследования. Проведен эксперимент с моделированием описторхоза у кроликов (Leporidae, Oryctolagus cuniculus). Эксперимент проводили в соответствии с Правилами проведения работ и использова- нием экспериментальных животных. Животные содержались в стандартных условиях вивария на смешанном сбалансированном рационе питания с оптимальным соотношением белков, жиров и углеводов. Группу наблюдения составили взрослые особи мужского пола (n=10), которые были заражены per os в инвазионной дозе 50 ме-тацеркариев Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884). Группу контроля составили клинически здоровые животные, которых не заражали Opisthorchis felineus (n=10). Предварительно из снулой рыбы (елец), полученной из реки Томь в районе г. Томска, на кафедре ихтиологии и гидробиологии Томского государственного университета были выделены активные метацеркарии, производился отбор лишь тех личинок, которые активно двигались в капсуле. Мышечная ткань рыб исследовалась в компрессориуме при увеличении в 100 раз с помощью светового микроскопа. Через месяц заражение подтверждалось наличием яиц паразита в кале животных при трехкратном исследовании лабораторными методами по Като-Миура, Paracep. Через 1,5 года после заражения приступали к исследованию системы крови.

Для морфологического анализа были изготовлены мазки периферической крови, по три микропрепарата от каждого животного. Кровь получена из капилляров правого уха животных. Ухо предварительно растирали, прокалывали скарификатором место, обработанное этиловым спиртом, первую каплю крови вытирали, а из последующих изготовляли микропрепараты. Их высушивали на открытом воздухе, а затем фиксировали и окрашивали в два этапа: метиленовым синим – эозином по Маю-Грюнвальду, азур 2 – эозином по Романовскому-Гимза. Для приготовления рабочего красящего раствора применяли соотношение 1:10 дистиллированной воды и коммерческого раствора Романовского-Гимза, для стабилизации рН добавляли концентрированный фосфатный буфер. Для нейтрализации окрашенных препаратов использована дистиллированная вода. Мазки периферической крови изучали иммерсионным методом световой светлопольной микроскопией, для описа- тельной морфологии форменных элементов при увеличении в 1000 раз.

На следующем этапе оценивались рН крови, для определения которой из капиллярной крови отделяли эритроцитарную массу путем центрифугирования в течение 5 минут со скоростью 100 об/мин. С помощью светового микроскопа при увеличении в 200 разс использованием метода толстой капли оценивалось пассивное движение эритроцитов in vitro. Капиллярную кровь наносили на часовое стекло и в нативных препаратах оценивали в секундах время до полной остановки пассивного движения эритроцитов. Формирование эритроцитарных агрегатов приводило к остановке их видимого перемещения. Время свертывания крови определяли по методу Бюргера в секундах. Результаты исследования биохимических маркеров крови в группах наблюдения и контроля (содержание ЛДГ, КФК-МВ, АСТ, АЛТ, мочевой кислоты) были опубликованы ранее [5]. Для статистической обработки результатов исследования использовали непараметрические методы статистики (U-критерий Манна-Уитни), различия считали значимыми при достижении уровня достоверности p < 0,05.

Результаты исследования и обсуждение. В группе наблюдения установлено наличие структурной гетероморф-ности лейкоцитов. Псевдоэозинофилы (аналоги нейтрофилов человека) имели в цитоплазме токсическую зернистость. У 19,5% псевдоэозинофилов, как палочкоядерных, так и сегментоядерных, отмечена вакуолизация цитоплазмы. В цитоплазме на периферии клетки у границы цитолеммы чаще присутствовала одна крупная светлая вакуоль, реже – две, разных размеров, расположенные рядом. Базофилы имели пустые участки цитоплазмы без гранул, в других участках сохранялась азурофильная зернистость. В результате фрагментарной дегрануляции цитоплазмы ядро визуализировалось, имело лопастную форму. У эозинофилов отмечали гиперсегментацию ядра (до 5 сегментов). В цитоплазме равномерно располагалась крупная, резкая оксифильная зернистость. Отдельные средние лимфоциты также имели единичные вакуоли. Малые лимфоциты характеризовались круглым гиперхромным ядром, узким ободком базофильной цитоплазмы без вакуолизации. Обнаружено значительное число форм лимфолиза (теней Боткина-Гумпрехта-Клейна) – 9,6% на 100 лейкоцитов. Моноциты встречались крайне редко, 0,04% на 100 лейкоцитов, имели бобовидное светлое ядро с нежным сетчатым хроматином, светлую слабо базофильную цитоплазму. Были обнаружены формы цитолиза моноцитов, которые отличались по остаткам ядер, сохранивших характерные черты строения (сетчатость хроматина, форма ядра). Число форм цитолиза моноцитов составило 4% на 100 лейкоцитов. В группе контроля встречались только формы лимфолиза в количестве 4% на 100 лейкоцитов.

При исследовании красных кровяных телец установлено наличие пойкило-цитоза; наиболее часто встречались акантоциты, дакриоциты. Анизоцитоз, обнаруженный в мазках периферической крови группы наблюдения, является вариантом нормы для кроликов [6]. Кровяные пластинки разной величины встречались в виде крупных конгломератов, имели сла-боокрашенный хромомер, широкий гиаломер. Часть кровяных пластинок в составе хромомера имели только единичные гранулы. Установлено, что рН крови в группе контроля было равно 7,4±0,8, что соответствует норме по литературным данным 7,2–7,5 [7-8]. В группе наблюдения рН крови составило в среднем 8,0±0,7, различия в сравниваемых группах носили характер тенденции. При микроскопическом наблюдении капли крови выявлено, что в группе контроля эритроциты in vitro в течение 59,8±15,2 секунд продолжали пассивно перемещаться, в группе наблюдения этот показатель составил в среднем 42,6±7,5 секунд, что превышает значения группы контроля на 17,2 секунды, различия статистически значимы (U=19, p<0,05). С формированием эритроцитарных агрегатов прекращалось видимое перемещение эритроцитов. Время свертывания крови в контрольной группе составило 101,9±32,1 секунд, а в группе наблюдения – 194,8±35,2 секунд, различия статистически достоверны (U=5, p < 0,05).

Исследование морфологии лейкоцитов в хронической фазе описторхоза продемонстрировало, что в их структуре наблюдаются значительные изменения. Известно, что снижение содержания АСТ и повышение холестерина и триглицеридов приводит к изменению мембран лейкоцитов при старении [9]. Содержание АСТ у животных опытной группы превышало значение контроля в 1,5 раза, а АЛТ – в 1,85 раза. Несмотря на то, что эти значения входят в диапазон нормальных, лейкоциты крови имели выраженные структурные изменения, что указывает на текущий воспалительный процесс в печени и патофизиологическое влияние на процесс кроветворения [5]. В работе Salao K. с соавт. показано повышение функции циркулирующих в крови нейтрофилов у лиц, инфицированных печеночной двуусткой [1011].

При хроническом описторхозе содержание КФК-МВ возрастало в 1,93 раза по сравнению с контролем [5]. В острой фазе описторхоза отмечается абсолютная лейкопения [3]. В лейкоцитарной формуле при описторхозе выявлены базофилия и псевдоэозинофильный лейкоцитоз [4]. Сочетание значительного числа лейкоцитов (преимущественно полиморфноядерных лейкоцитов) и высоких значений КФК-МВ специфично для инфаркта миокарда, инфаркта мозга [12]. При хроническом течении описторхоза выявляются дегенеративно-деструктивные изменения ядра и цитоплазмы лейкоцитов. Мышечная фракция КФК-МВ является диагностически значимой при поражении в ранние сроки поперечнополосатой сердечной мышечной ткани и в более поздние сроки – волокон поперечнополосатой соматической мышечной ткани, щитовидной железы и легких. Данный фермент обеспечивает энергетический обмен клеток разных тканей. АТФ и креатин образуют высокоэнергетическое вещество креатинфосфат, используемый при повышенных физических нагрузках. В хронической фазе опи-сторхоза через 1,5 года после заражения были обнаружены гиперсегментация ядер эозинофилов, нарушение структуры зернистости цитоплазмы базофилов. КФК-МВ может повышаться при попадании в организм лекарственных препаратов, иммуносупрессоров (циклоспорина), кортикостероидов [12]. При описторхозе повышение КФК-МВ может быть обусловлено гиперфункцией надпочечников с увеличением выработки кортикостероидов, которые стимулируют микрофаги и макрофаги слизистых оболочек, но при этом вызывают массовый апоптоз лимфоцитов крови. Это подтверждается наличием в крови зараженных животных повышенного числа форм лимфолиза (теней Боткина-Гумпрехта-Клейна) и форм цитолиза моноцитов, по сравнению с контролем.

При действии различных патогенных факторов инфекционной и неинфекционной природы красный костный мозг может реагировать угнетением кроветворения, а также появлением (иногда и преобладанием) дегенеративных форм эритроцитов. Изменение формы эритроцитов может являться следствием сдвига кислотно-щелочного равновесия крови, нарушений работы печени и выделительной системы. При исследовании красных кровяных телец в мазках крови группы наблюдения установлено наличие пойкилоцито-за. Известно, что агрегацию эритроцитов, их деформацию может вызывать высокая концентрация крупномолекулярных белков (фибриногена, факторов свертывания крови). Форма эритроцитов зависит от осмотического и онкотического давления, состояния мембраны, работы ионных каналов [13-14]. Акантоциты и эхиноциты (эритроциты шиповатой формы) встречаются при поражениях печени, наследственных дефектах пируваткиназы [15]. Следовательно изменение формы эритроцитов может быть связано с нарушением их мембран в кровеносном русле или изменением структурной и молекулярной организации на этапе эритропоэза.

Одним из энергетических процессов, используемых эритроцитами, является путь Эмбдена-Мейергофа, в котором на десятом этапе ЛДГ играет ключевую роль в восстановлении пирувата до лактата, oт протекания фосфорилирования, кальциевого обмена зависит деформация сдвига, а именно нарушение формы клетки из-за повреждения цитоскелетного белка спектрина [15]. Следовательно, пойкилоцитоз с преобладающим формированием акантоцитов и дакриоцитов может быть обусловлен окислительным стрессом. В организме хозяина паразит постоянно находится под действием свободных радикалов, вырабатываемых клетками иммунной системы, однако за счет наличия у него окислительно-восстановительного метаболизма на основе тиолов, он выживает [16]. В этом случае клетки организма хозяина могут быть повреждены собственными ферментативными системами. Содержание в крови фермента ЛДГ возрастает при повышенном разрушении клеток и тканей [15]. Множество вовлеченных клеток разрушается при инвазии, как контактных с паразитом, так и удаленно расположенных. Паразиты группы описторхид (например, Opisthorchis viverrini) увеличивают концентрацию провоспалительных молекул, индуцируют повышенную экспрессию TLR-2, COX-2 и SOD-2 и пониженную экспрессию генов CAT у пациентов, дисбаланс оксидантов/антиоксидантов, изменяют углеводный и липидный обмен, даже при специальной диете [17-19].

При описторхозе отмечается изменение времени свертывания крови, в острой фазе заболевания оно резко сокращается, в хронической фазе, наоборот, удлиняется. Ключевая роль в этом процессе принадлежит кровяным пластинкам, взаимодействию противосвертывающей и свертывающей систем. Хронический опи-сторхоз сопровождается снижением противосвертывающего потенциала эндоте-