Сравнительный анализ профилей экспрессии генов опухолевого контроля и микроРНК в опухолевой и перифокальной ткани у пациентов с колоректальным раком

Колоректальный рак (КРР) занимает лидирующие позиции в структуре заболеваемости и смертности среди всех злокачественных новообразований. Хирургическое удаление опухоли с последующей химиотерапией является стандартом лечения КРР. Общепризнанным подходом к выбору края резекции опухоли при КРР является иссечение кишки в пределах не менее 10 см от опухоли при операциях по поводу рака ободочной кишки, не менее 5 см – при операциях по поводу рака дистальной трети сигмовидной кишки, ректосигмоидного отдела толстой кишки и рака прямой кишки [1, 2]. Однако по данным анализа 17 исследований ширина резекции 1 см и более может быть достаточной в отдельных случаях при раке прямой кишки, и это не увеличивает риск рецидива [3]. Аналогичные данные в обзоре представил C.-G. Ker, где безопасное расстояние при хирургическом лечении рака прямой кишки составило от 1 до 3 см [4].

Отсутствие опухолевой ткани в конкретной области может быть подтверждено гистологически. Однако существуют генетические особенности, которые могут быть определены только путем молекулярно-генетического исследования. Имеющиеся данные дают основания для оценки различий геномного профиля опухолевой и перифокальной тканей. На образцах опухолей и прилежащей нормальной ткани толстой кишки мышей показано, что профиль экспрессии генов значимо отличается в опухолевой и перифокальной нормальной ткани на расстоянии 1–2 см и 4 см от опухоли [5]. Однако до сих пор нет данных о качественных различиях опухолевой и перифокальной ткани на генном уровне у пациентов с КРР в зависимости от расстояния от опухоли.

В онкогенезе и метастазировании КРР участвует множество различных факторов: белков сигна-линга, межклеточного взаимодействия, факторов транскрипции, эпигенетических факторов. Одним из наиболее изученных сигнальных путей, повреж- дающихся при КРР, является путь фактора роста опухоли (TGF-B) [6]. M. Nakano et al. показали, что сигнальный путь TGF-B участвует в прогрессировании КРР, приводя к дедифференцировке неопухолевых стволовых клеток в опухолевые стволовые [7].

Другими важными факторами контроля онкогенеза КРР являются гены семейства E2F . Так, ген E2F3 обеспечивает точную передачу генетического материала каждой дочерней клетке во время клеточного цикла [8]. Однако он может участвовать и в развитии опухолевого процесса. В частности, показано, что уровни экспрессии E2F3 были выше в опухолевых тканях, что может быть причиной усиления пролиферации и роста клеток КРР [9]. Существует универсальный фактор – ген NFkB . Он является важным участником в передаче сигналов, способствующих развитию метастатического процесса при КРР [10]. Экспрессия рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) наблюдается в большинстве случаев КРР, при этом гиперэкспрессия EGFR достоверно связана с плохим прогнозом и чаще наблюдается при распространенном опухолевом процессе [11]. Семейство Круппель-подобных транскрипционных факторов ( KLF ) также участвует в контроле роста, пролиферации, апоптоза и ангиогенеза. В частности, KLF8 способствует онкогенезу, инвазии и метастазированию клеток КРР [12], а потеря KLF3 коррелировала с агрессивными фенотипами и плохими результатами выживания [13]. Матриксная металлопротеиназа 9 (MMP9), известная также как «желатиназа В», участвует в ремоделировании структур внеклеточного матрикса. Изменение экспрессии MMP-9 может влиять на эффективность лечения злокачественных новообразований. Например, гиперэкспрессия MMP9 предсказывает плохую выживаемость и хороший ответ на химиотерапию у пациентов с КРР [14].

МикроРНК представляют собой большую группу некодирующих РНК, которые не могут быть транслированы в белок. МикроРНК регулируют экспрессию более 30 % генов человека [15]. Аномальная экспрессия микроРНК является значимым элементом канцерогенеза [16]. Низкая экспрессия микроРНК-15 коррелирует с плохим прогнозом пациента с КРР [17]. Гиперэкспрессия микроРНК-15 увеличивает чувствительность клеток рака толстой кишки к 5-фторурацилу и оксалиплатину [18]. Снижение экспрессии микроРНК-16 может быть маркером плохого прогноза [19]. W. Zhang et al. показали в метаанализе, что низкий уровень экспрессии микроРНК-16 был связан с плохим прогнозом при солидных опухолях [20]. Повышенная экспрессия микроРНК-21 и микроРНК-210 наблюдается при КРР [19, 21]. По данным метаанализа, гиперэкспрессия микроРНК-21 при колоректальном раке связана с плохой выживаемостью [22].

Перечисленные выше гены играют важную роль в онкогенезе КРР и могут служить отличительными характеристиками опухолевого процесса. Это дает возможность провести сравнительный анализ экспрессии генов для определения различия между опухолевой тканью и перифокальной тканью на расстоянии 1–2 см.

Цель исследования – изучить профили экспрессии генов опухолевого контроля ( E2F3, TGFB, NFKB, KLF-12, EGFR и MMP9 ), а также экспрессии генов микроРНК ( микроРНК-15, -16, -21 и -210 ) в опухолевой и перифокальной здоровой тканях при КРР.

Материал и методы

Исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией [23]. С 02.2020 по 04.2021 в обсервационное исследование было включено 20 пациентов, из них 13 мужчин и 7 женщин (табл. 1), которые соответствовали критериям включения и подписали информированное согласие. Из анализа был исключен 1 пациент (мужчина) в связи с наличием значительного воспалительного компонента в биопсийных тканях, что могло исказить окончательные результаты. В исследование были включены мужчины и женщины в возрасте от 42 до 80 лет с подозрением на КРР, которым в плановом порядке производили верификацию опухоли. Все пациенты с верифицированным КРР получали стандартное лечение в соответствии с национальными и международными рекомендациями по клинической практике с учетом стадии заболевания.

У каждого пациента с помощью видеоколоноскопии была выполнена биопсия опухоли и нормальной здоровой эпителиальной ткани толстой кишки. Участок «здоровой» ткани выбирался визуально врачом-эндоскопистом на расстоянии 1–2 см от опухоли. Биоматериал (опухоль и здоровая ткань кишечника) исследовали на уровни экспрессии генов опухолевого контроля ( E2F3, TGFB, NFKB, KLF-12, EGFR и MMP9 ), относительно референц-гена GAPDH , а также на уровни экспрессии генов микроРНК ( микроРНК-15, -16, -21 и -210 ), используя в качестве референц-гена малую ядерную РНК U6 .

Исследование относительной экспрессии генов опухолевого контроля, а также генов микроРНК проводили по полуколичественному протоколу [24]. Тотальную РНК выделяли из биоматериала (биопсийный материал) с помощью реактива ExtractRNA (Евроген, Москва) в соответствии с инструкцией.

Для приготовления кДНК генов опухолевого контроля использовали набор для обратной транскрипции «ОТ-1» (Синтол, Москва) в модификации для гексануклеотидных праймеров, согласно инструкции. Приготовление кДНК генов микроРНК проводили технологией StemLoop со специфическими праймерами, раздельно для

Таблица 1/table 1

Характеристика/Characteristics	Значение/Values
Возраст, лет/Age, years	63,2 ± 11
Мужчины/Males	12 (63 %)
Женщины/Females	7 (37 %)
N0	10 (53 %)
N+	9 (47 %)
Стадия I/Stage I	5 (26 %)
Стадия II/Stage II	4 (21 %)
Стадия III/Stage III	4 (21 %)
Стадия IV/Stage IV	6 (32 %)
Low-grade High-grade	16 (84 %) 3 (16 %)
M1 HEP	5 (26 %)
M1 PUL/PLE	3 (16 %)
Левая половина ободочной кишки, рак прямой кишки/Left side of the colon, rectal cancer	15 (80 %)
Правая половина ободочной кишки/Right half of the colon	2 (10 %)
Первично-невыясненная локализация/Primary unexplained localization	2 (10 %)

Примечание: Low-grade – низкая степень злокачественности; High-grade – высокая степень злокачественности; M1 HEP – наличие метастазов в печени; M1 PUL/PLE – наличие метастазов в легких и/или плевре.

Характеристика пациентов characteristics of patients

Note: Low-grade – low degree of malignancy; High-grade – high degree of malignancy; M1 HEP – the presence of metastases in the liver; M1 PUL/ PLE – the presence of metastases in the lungs and / or pleura.

Таблица 2/table 2

Последовательности праймеров для обратной транскрипции генов микроРНК primer sequences for reverse transcription of miRNa genes

МикроРНК/MicroRNA	Последовательности праймеров/Primer sequences
МикроРНК-15	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAA
МикроРНК-16	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA
МикроРНК-21	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAAC
МикроРНК-210	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCC

U6            GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG каждой микроРНК и гена сравнения U6 (табл. 2) с использованием набора для обратной транскрипции «ОТ-1» (Синтол, Москва). Температурный профиль реакции был следующий: 16 ºС – 30 мин, 42 ºС – 30 мин, 85 ºС – 5 мин.

В качестве полимеразной цепной реакции (ПЦР) смеси была использована 2,5× реакционная смесь с интекалирующим красителем EVA Green (Синтол, Москва). Амплификацию проводили в режиме RealTime на приборе DTLite-4 (ДНК-Технология, Москва) по стандартной двухпраймерной схеме по полуколичественному протоколу. Праймеры для ПЦР представлены в табл. 3. Температурный профиль амплификации генов опухолевого контроля: 95 ºС – 7 мин, затем 40 циклов (95 ºС – 15 сек и 56 ºС – 1 мин), для микроРНК: 95 ºС – 5 мин, затем 45 циклов (95 ºС – 15 сек и 60 ºС – 1 мин). Оценку относительного уровня экспрессии генов проводили по протоколу ΔСt и рассчитывали по формуле 2(-(А-В)), где А – Ct гена микроРНК, а В – Ct гена U6 [25]. Полученный результат выражали в условных единицах экспрессии (УЕ).

Статистический анализ проводили с использованием непараметрических методов. Тип распределения был протестирован с использованием гистограмм распределения и критериев Шапиро– Уилка и Колмогорова–Смирнова. Категориальные данные представлены как частота и процент. Непрерывные переменные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Количественные параметры когорт сравнивали с использованием критерия Манна–Уитни. Корреляции между стадией, степенью злокачественности, локализацией первичной опухоли, поражением лимфатических узлов и печени, с одной стороны, и всеми факторами – с другой анализировали с использованием ранговой корреляции Спирмена. Уровень p<0,05 считался статистически значимым. Для статистических тестов использовали программный пакет SPSS 23.0 (IBM, Чикаго, Иллинойс).

Результаты

Оценка уровней экспрессии генов опухолевого контроля проводилась путем сравнения экс-

Таблица 3/table 3

Ген/Gene	Последовательности праймеров/Primer sequences
E2F3 (прямой)/(forward)	GCACTACGAAGTCCAGATAGTCC
E2F3 (обратный)/(reverse)	AGACTGCAGCCCATCCATTG
TGFB (прямой)/(forward)	GCCCTGGACACCAACTATTG
TGFB (обратный)/(reverse)	CGTGTCCAGGCTCCAAATG
NFKB (прямой)/(forward)	CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG
NFKB (обратный)(reverse)	GAGGACCTGGGAGTAGATGAG
EFFR (прямой)/(forward)	GGGTTCAGAGGCTGATTGTGATAGA
EGFR (обратный)(reverse)	CGCCTTGACTGAGGACAGCATA
KLF-12 (прямой)/(forward)	CACCTGGAAATGTGAACAACA
KLF-12 (обратный)/(reverse)	TTTTACTTTGTCTGGGAGATAGGC
MMP9 (прямой)/(forward)	CGCAGACATCGTCATCCAGT
MMP9 (обратный)/(reverse)	GGATTGGCCTTGGAAGATGA
GAPDH (прямой)/(forward)	AGAAGGCTGGGGCTCATTTG
GAPDH (обратный)/(reverse)	AGGGGCCATCCACAGTCTTC
МикроРНК-15/MicroRNA-15	GACGCCTAGCAGCACATA
МикроРНК-16/MicroRNA-16	CCGGAGTAGCAGCACGTAAAT
МикроРНК-21/MicroRNA-21	GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG
МикроРНК-210/MicroRNA-210	CAGAGTGCTGTGCGTGTGA
U6	GCGCGTCGTGAAGCGTTC
Общий праймер для микроРНК/Total primer for microRNA	GTGCAGGGTCCGAGGT

Последовательности праймеров для ПЦР pcR primer sequences

прессии в двух группах: 1) опухолевый биоптат и 2) визуально здоровая перифокальная область. Относительные уровни экспрессии генов E2F3, TGFB, NFKB, KLF-12, EGFR и MMP9 представлены на рис. 1. Уровень экспрессии гена E2F3 был статистически значимо выше в нормальной ткани по сравнению с опухолевой (Медиана 6,5, Q1-Q3 6,39 УЕ vs Медиана 3,73, Q1-Q3 2,64 УЕ, p=0,01).

Уровни экспрессии остальных генов не показали статистически значимых отличий в исследуемых группах.

Оценка уровней экспрессии генов опухолевого контроля проводилась также путем сравнения экспрессии в группах материала кишки из фокуса опухоли и здоровой перифокальной области. Относительные уровни экспрессии генов микроРНК-15,

Рис.1. Экспрессия генов опухолевого контроля в нормальной и опухолевой тканях.

Примечание: Normal – визуально здоровая перифокальная ткань; Tumor – опухолевая ткань; УЕ – условные единицы Fig. 1. Expression of tumor control genes in normal and tumor tissues.

Note: Normal – visually healthy perifocal tissue; Tumor – tumor tissue; УЕ (REU) – relative units of expression

• -16, -21 и -210 представлены на рис. 2. Уровень экспрессии генов микроРНК-16 был статистически значимо выше в нормальной ткани (Медиана 4,29, Q1-Q3 3,73 УЕ vs Медиана 2,83, Q1-Q3 4,74 УЕ, p=0,027), а уровень экспрессии генов микроРНК-21 , наоборот, статистически значимо оказался выше в опухолевой ткани (Медиана 2,64, Q1-Q3 1,38 УЕ vs Медиана 1,41, Q1-Q3 1,21 УЕ, p<0,001).

При многофакторном анализе корреляций уровней экспрессии исследуемых генов в ткани опухоли между собой и клиническими данными были получены следующие результаты. Существует положительная корреляция экспрессии генов E2F3 с TGFB и NFkB (r=0,67, p=0,035 и r=0,73, p<0,001 соответственно). Также выявлена положительная корреляция между экспрессией генов TGFB и NFkB (r=0.84, p=0,002). Найдена сильная положительная корреляция экспрессии генов EGFR с KLF и MMP-9 (r=0,81, p=0,004 и r=0,84, p=0,003 соответственно). Кроме того, зарегистрирована корреляция между экспрессиями генов KLF-12 и MMP-9 (r=0,66, p=0,038).

При оценке связи экспрессии исследуемых генов с клиническими данными выявлена отрицательная корреляция уровня экспрессии генов микроРНК-210 с опухолевым поражением лимфатических узлов, метастатическим поражением печени и стадией опухолевого процесса (r=-0,59, p=0,008; r=-0,54, p=0,018; r=-0,60, p=0,007 соответственно). Также обнаружена корреляция экспрессии генов микроРНК-210 с микроРНК-16 и микроРНК-15 (r=0,55, p=0,014 и r=0.70, p=0,025 соответственно). Отдельно хотелось бы подчеркнуть отсутствие корреляций микроРНК-21 со всеми исследуемыми генами.

При многофакторном анализе корреляций уровней экспрессии исследуемых генов между собой в перифокальной области были получены следующие результаты. Обнаружено наличие высокодостоверной статистической положительной корреляции экспрессии гена E2F3 и генов KLF-12 и NFkB (r=0,49, p=0,035 и r=0,72, p=0,001 соот- ветственно). Схожие экспрессионные характеристики имел и ген EGFR с генами KLF-12 и NFkB (r=0,85, p=0,002 и r=0,65, p=0,042 соответственно). Дополнительно к указанным ген KLF-12 имел положительную корреляцию с экспрессией генов TGFB и NFkB (r=0,69, p=0,029 и r=0,62, p=0,004 соответственно) и отрицательную корреляцию с экспрессией микроРНК-15 (r=-0,65, p=0,043), -16 (r=-0,63, p=0,004) и -210 (r=-0,47, p=0,040). Экспрессия гена MMP-9 коррелировала с таковой гена TGFB (r=0,78, p=0,008). Также выявлена положительная корреляция экспрессий генов TGFB и NFkB (r=0,65, p=0,042).

При оценке экспрессионных взаимодействий генов микроРНК показано, что микроРНК-15 имела отрицательную корреляцию с генами TGFB (r=-0,67, p=0,033) и NFkB (r=-0,71, p=0,023) и положительную с микроРНК-16 (r=0,67, p=0,035), -21 (r=0,90, p<0,001) и 210 (r=0,66, p=0,038). Дополнительно, экспрессия микроРНК-210 высоко коррелировала с микроРНК-16 (r=0,59, p=0,008).

Обсуждение

Настоящая работа посвящена изучению экс-прессионного профиля некоторых генов, в том числе и регуляторных, включенных в онкологический процесс, в опухолевой и перифокальной тканях при КРР. В качестве исследуемого материала использовались биоптаты, полученные при колоноскопии. Перифокальная область рассматривалась как ткань толстой кишки в 1–2 см от видимого опухолевого очага. Были найдены значимые отличия в экспрессии генов E2F3 , микроРНК-16 и микроРНК-21 в опухолевой и перифокальной тканях на расстоянии 1–2 см от опухоли. В нашей работе не обнаружено достоверных различий в экспрессии генов опухолевого контроля TGFB , NFKB , KLF-12 , EGFR и MMP9 , а также экспрессии генов микроРНК-15 и микроРНК-210 .

Согласно полученным данным, уровень экспрессии E2F3 в нормальной ткани оказался выше, чем в опухолевой ткани. Повышение уровня экспрессии E2F3 наблюдается при усилении пролифе-

Рис. 2. Экспрессия генов микроРНК в нормальной и опухолевой тканях. Примечание: Normal – визуально здоровая перифокальная ткань;

Tumor – опухолевая ткань;

УЕ – условные единицы

Fig. 2. Expression of microRNA genes in normal and tumor tissues Note: Normal – visually healthy perifocal tissue; Tumor – tumor tissue; УЕ (REU) – relative units of expression

рации и роста клеток [9]. Повышенный рост клеток нормальной ткани несет риски злокачественного перерождения и прогрессирования. С другой стороны, сниженная экспрессия E2F3 в опухолевой ткани также является неблагоприятным признаком, так как может служить причиной генетической нестабильности и тем самым увеличивать метастатический потенциал опухолевых клеток [8].

Выявлено, что у пациентов с повышенной экспрессией E2F3 повышены также экспрессии TGF-B и NFkB . Белок NFkB является частью сигнального пути AKT/NFkB/MDR1, ответственного за развитие резистентности к лекарственной терапии при колоректальном раке [26]. Учитывая наличие корреляции с NFkB , высокая экспрессия E2F3 потенциально является прогностическим фактором развития лекарственной устойчивости. Данное наблюдение может быть подтверждено только в рамках последующих клинических исследований.

Нарушение регуляции экспрессии микроРНК связано с инициацией и прогрессированием злокачественного новообразования. Негативные последствия в отношении прогноза при КРР имеет изменение экспрессии нескольких микроРНК .

Выявлена низкая экспрессия микроРНК-16 в опухолевой ткани по сравнению с перифокальной. Известно, что микроРНК-16 снижает пролиферацию и индуцирует апоптоз опухолевых клеток при колоректальном раке [27]. C. Farace et al. сообщили, что низкая экспрессия микроРНК-16 при колоректальном раке является неблагоприятным прогностическим фактором [19]. Сниженная экспрессия микроРНК-16 в опухолевой ткани в нашей работе может являться фактором негативного прогноза.

Уровень экспрессии микроРНК-21 оказался выше в опухолевой ткани. Как показали Y. Wu et al., микроРНК-21 при колоректальном раке способствует росту и инвазии опухолевых клеток с помощью подавления активности опухолевого супрессора PTEN [28]. Y. Yu et al. показали в метаанализе, что повышенная экспрессия микроРНК-21 в тканях предсказывала снижение общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования у пациентов с КРР [22]. Повышенная экспрессия микроРНК-21 в опухолевой ткани в нашей работе может являться негативным прогностическим фактором рецидива и прогрессирования колоректального рака.

Уровень экспрессии микроРНК-210 в перифокальной ткани оказался выше, чем в опухолевой, хотя разница и не была статистически значима. Как показали K.E. Tagscherer et al., гиперэкспрессия микроРНК-210 может индуцировать апоптоз опухолевых клеток через ROS механизм [29]. Однако в работах других авторов было показано, что экспрессия микроРНК-210 повышена при опухолевом процессе [19, 21], в особенности в условиях гипоксии [30]. Учитывая эти данные, не исключено, что высокая экспрессия микроРНК-210 в нормальной перифокальной ткани может быть фактором повышенного риска рецидива, развития опухоли de novo и неблагоприятного прогноза. Обнаружено, что чем ниже экспрессия генов микроРНК-210 в опухолевой ткани, тем более вероятно метастатическое поражение лимфатических узлов, печени, а также выше стадия опухолевого процесса.

Кроме того, выявлена корреляция экспрессии EGFR с KLF и MMP-9 , а также корреляция экспрессии KLF и MMP-9 между собой. EGFR и KLF являются важными участниками роста опухолевых клеток, в то время как MMP-9 участвует в ремоделировании структур внеклеточного матрикса и может обеспечивать необходимые изменения в ткани, способствуя развитию опухолевого процесса. Гиперэкспрессия этих факторов связана с плохим прогнозом при КРР [11, 12, 14].

Важно отметить, что при перекрестном анализе экспрессионных ландшафтов нормальной и опухолевой ткани нами был выявлен ряд идентичных взаимосвязей. Так, экспрессия микроРНК-210 имела одинаково достоверную корреляцию с микроРНК-15 и -16 , ген NFkB – с генами E2F3 и TGFB , а ген KLF-12 – с геном EGFR .

Таким образом, опухолевая и перифокальная ткани при КРР имеют значимые различия в уровнях экспрессии генов E2F3 , микроРНК-16 и микроРНК-21 , определяющих регуляцию опухолевого процесса.

Заключение

Обнаружено снижение уровня экспрессии E2F3 и микроРНК-16 и повышение уровня экспрессии микроРНК-21 в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью у пациентов с КРР. Это дает возможность дифференцировать опухолевую и перифокальную ткань на расстоянии 1–2 см от опухоли не только гистологическим, но и молекулярно-генетическим методом исследования. Повышенный уровень экспрессии E2F3 и микроРНК-16 на расстоянии 1–2 см от опухоли может быть предиктором злокачественного перерождения, рецидива и прогрессирования опухоли. Экспрессия гена E2F3 коррелирует с уровнем экспрессии гена NFkB , ответственного за развитие резистентности к лекарственной терапии, и потенциально может служить неблагоприятным прогностическим фактором лекарственной устойчивости. Повышенная экспрессия микроРНК-21 в опухолевой ткани может являться негативным прогностическим фактором.

Существует возможная диагностическая ценность таких факторов, как микроРНК-210 , KLF и MMP-9 . Повышенная экспрессия микроРНК-210 в перифокальной ткани, а KLF и MMP-9 в опухолевой ткани может быть фактором рецидива и неблагоприятного прогноза.

Совместная оценка экспрессионных характеристик генов контроля опухолевого роста и генов-регуляторов – микроРНК – в опухолевой и нормальной ткани на до- или интраоперационном этапах, безусловно, может рассматриваться как потенциальный прогностический критерий. Так, возможно, чем более различным является характер генетической дисрегуляции в ткани опухоли и перифокальной ткани, остающейся после резекции,