Сравнительный анализ респираторных реакций на микроинъекции L-глутамата в различные структурно-функциональные отделы вестибулярного ядерного комплекса мозга новорожденных крыс in vitro

Морфо-функциональное развитие нейронных структур ВЯК, как и респираторной нейронной сети, происходит в период раннего постнатального онтогенеза путем формирования функции разных медиаторных систем. Как известно, именно при участии медиаторных систем осуществляются регулирующие и модулирующие синаптические влияния на дыхательный центр (Gittis, du Lac, 2007; Pasqualetti et al., 2007; Пятин и др., 2016a,б; Татарников и др., 2017).

У взрослых животных основная роль в механизмах синаптического взаимодействия ВЯК со структурами бульбарного дыхательного центра принадлежит глутаматергической системе (Уates, Bronstein, 2005). Однако роль глутаматергической системы ВЯК в механизмах реализации его регулирующих влияний на дыхательный центр новорожденных животных в настоящее время остаётся не раскрытой, что делает актуальным исследование функций этой области мозга в регуляции дыхания в раннем постнатальном онтогенезе.

Целью настоящего исследования являлось изучение роли различных структурно-функциональных отделов вестибулярного комплекса ядер в реализации респираторных реакций в изолированных понтобульбоспинальных препаратах новорожденных крыс in vitro.

Методика. Эксперименты выполнены на 48 изолированных понтобульбоспинальных препаратах (ПБСП), полученных из мозга белых и пигментированных беспородных крыс в возрасте от 0 до 4 суток, в условиях in vitro. Подготовка объекта для экспериментального исследования осуществлялась в два этапа. На первом этапе животных наркотизировали эфиром и помещали в специальную установку для проведения подготовительной операции. Путем дорсальной кранио- и ламинэктомии обнажали головной мозг и шейные сегменты спинного мозга. Ствол мозга пересекался на межколликулярном уровне. Во время препарирования мозг животных непрерывно орошался искусственной цереброспинальной жидкостью, охлажденной до +10°С и насыщаемой смесью кислорода (95%) и углекислого газа (5%). Препарат высвобождали от мозговых оболочек и последовательно пересекали дорсальные и вентральные корешки спинного мозга под контролем бинокулярного микроскопа. Кроме того, препарировали волокна с V по XII пары черепно-мозговых нервов. По окончании препарирования температуру перфузионного раствора, орошающего ПБСП, постепенно повышали с +10°С до +25±0,5°С и затем пересекали спинной мозг на уровне VI-VII пары вентральных корешков.

На втором этапе изолированный ПБСП переносили в проточную термостатированную камеру (+25±0,5°С) и помещали в специальное фиксирующее устройство камеры дорсальной поверхностью вверх для осуществления визуального контроля места микроинъекции. Скорость суперфузии ПБСП мозга составляла в среднем 2,5 мл/мин. В экспериментах на изолированном ПБСП мозга новорожденных животных использовался раствор искусственной цереброспинальной жидкости (ИЦСЖ) следующего состава (моль/л): NaCI - 124,0; КС1 -

5,0; СаСЕ - 2,4; MgSO4 - 1,3; NaHCO3 - 26; КН2РО4 - 1,2; d-глюкоза -30 (по Suzue, 1984). В течение всего эксперимента pH раствора ИЦСЖ в регистрационной камере поддерживали постоянным на уровне 7,3±0,05.

О спонтанной генерации ритма в дыхательном центре ПБСП мозга новорожденных крыс судили по суммарной биоэлектрической активности диафрагмальных мотонейронов. С этой целью отводилась биоэлектрическая активность от С4-С5 вентральных корешков спинного мозга с помощью хлорсеребряного всасывающего электрода (внутренний диаметр 100-150 мкм). Отводимые разряды диафрагмальных мотонейронов усиливали с помощью усилителя переменного тока (DL 314N-725; Neurobiolab Company), подавали на вход аналого-цифрового преобразователя (L-Card El4-440, FBM Engineering) и записывали на жесткий диск персонального компьютера в формате wav.

Раствор Е-глутамата (50 мМоль/л; Sigma Chemicals, USA) вводили в мозг с помощью микрошприца МШ-1 через стеклянную микропипетку с диаметром кончика 20-30 мкм под контролем бинокулярного микроскопа. Вещество растворяли ex tempore в ИЦСЖ и вводили в объеме 20-30 ил. Микропипетку в соответствии со стереотаксическими координатами вводили в исследуемые структуры и удерживали там в течение всего времени наблюдения во избежание распространения вещества вверх по треку (таблица).

Таблица 1

Координаты точек микроинъекций веществ в различные функциональноспецифические области вестибулярного комплекса ядер (в мм)

Структура вестибулярного комплекса	Ростральнее obex	Латеральнее средней линии мозга	Вглубь от дорсальное поверхности мозга
Медиальное ядро: Ростральная часть	1,8	0,5	0,2
Каудальная часть	1,0	0,5	0,2
Латеральное ядро	1,8	1,0	0,5
Спинальное ядро	1,5	1,0	1,0
Верхнее ядро	2,2	1,5	0,5

В контрольных экспериментах по аналогичной методике инъецировали ИЦСЖ в том же объеме. Для гистологического контроля места микроинъекции по окончании эксперимента ПБСП фиксировали в 10% растворе формалина, после стандартной гистологической проводки заключали в парафиновый блок, из которого готовили коронарные срезы толщиной 10-20 мкм, с последующей окраской тионином по методу Ниссля (Буреш с соавт., 1991). Для сравнения использовали микрофотографии поперечных срезов мозга новорожденных крыс и атлас мозга взрослой крысы (Paxinos, Watson, 1997).

При обработке полученных нейрограмм оценивали следующие параметры: продолжительность респираторного цикла (с), время респираторного разряда (с), амплитуду респираторного разряда (относительные единицы). Для определения степени вариабельности параметров использовали коэффициент вариации - отношение среднего квадратичного отклонения к величине средней арифметической. Для описания пиков спектра респираторных разрядов использовали следующие параметры: частота пика (Гц) и мощность пика (относительные единицы). Средние показатели рассчитывали на основании данных, полученных от 10 последовательных респираторных залпов.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически с помощью программного пакета SigmaStat 2.0 с использованием непарного и парного t-теста Стьюдента. Все данные представлены как средние значения±стандартные ошибки. Для построения графиков пользовались программным пакетом Sigma Plot 10.0 (Jandel Scientific, USA). Статистически значимыми считались изменения со значениями р < 0,05.

Результаты и обсуждение. В серии экспериментов исследованы реакции биоэлектрической активности, регистрируемой в С4-С5 вентральных корешках ПБСП мозга 0-3 суточных новорожденных крыс, на микроинъекции глутамата в область рострального и каудального отделов медиального вестибулярного ядра (МВЯ), латерального (ЛВЯ), спинального (СВЯ) и верхнего вестибулярных ядер (ВВЯ). Установлено, что стимуляция глутаматергической системы ВЯК вызывает два типа ответных реакций со стороны бульбарного дыхательного центра: инспираторно-активирующие и инспираторно-ингибирующие, при этом выявлена четкая зависимость типа эффекта от локализации воздействия (рисунок).

Так, инспираторно-ингибирующий эффект наблюдали только в случае микроинъекции глутамата в ростральную часть МВЯ, при этом нами были выявлены возрастные особенности наблюдаемых реакций у ПБСП мозга 0-1 суточных (п=10) и 2-3 суточных (п=6) новорожденных крысят. В возрастной группе ПБСП 0-1 суточных крысят в 95% случаев нами было зарегистрировано полное торможение спонтанной активности дыхательного центра. Средняя продолжительность респираторного цикла при этом почти в 5,5 раз превышала величину данного показателя в исходных условиях (р<0,001; парный t-тест). В отдельных экспериментах продолжительность депрессии респираторного ритма составляла более 20 мин. В возрастной группе ПБСП 2-3 суточных крысят микроинъекция глутамата в ростральный отдел МВЯ также вызывала уменьшение частоты генерации респираторных залпов в С4-С5 вентральных корешках за счет значительного увеличения общей продолжительности дыхательного цикла в среднем на 203,4±12,5 % (р<0,01; парный t-тест). При этом обнаружены статистически значимые различия в изменении данного параметра между исследуемыми возрастными группами ПБСП мозга (р<0,01; t-тест).

Характерной особенностью, сопровождающей снижение ритмической активности дыхательного центра в обеих возрастных группах ПБСП, являлось резкое повышение вариабельности длительности респираторного цикла, что указывает на нерегулярность процесса генерации дыхательного ритма. На спектрограммах респираторных разрядов ПБСП мозга 0-1 суточных крысят происходило значительное увеличение мощности низкочастотного пика в среднем на 132,5±24,1% (р<0,05; парный t - тест), тогда как на спектрограммах респираторных разрядов ПБСП мозга 2-3 суточных крысят на фоне введения глутамата в исследуемую область наблюдали снижение мощности осцилляций низко- и среднечастотного диапазонов на 34,2±6,4% (р<0,05; парный t-тест) и 31,3±5,7% (р>0,05; парный t-тест) соответственно.

В целом, оценка изменений спектральных характеристик респираторных разрядов на фоне микроинъекции L-глутамата в ростральную область МВЯ свидетельствует о том, что данная структура вестибулярного ядерного комплекса у новорожденных крыс не только тормозит процессы дыхательного ритмогенеза, но и модулирует активность генератора инспираторного паттерна. Что касается возрастных особенностей изменений биоэлектрической активности, зарегистрированной в С4-С5 вентральных корешках в условиях данных экспериментов, то согласно данным ряда авторов, на протяжении первых трех суток после рождения как в дыхательном центре, так и в вестибулярном ядерном комплексе новорожденных крыс и мышей происходит активное изменение экспрессии рецепторов к медиаторам, в том числе к глутамату и ГАМК, что может обусловливать обнаруженные нами различия (Onimaru, Homma, 2002; Eugene et al., 2007; Pasqualettie et al., 2007; Тюрин, 2009).

В сериях опытов с микроинъекциями глутамата в каудальную часть МВЯ (п=8), а также ЛВЯ (п=8) и СВЯ (п=8) были зарегистрированы инспираторно-активирующие ответные реакции дыхательного центра. В этих сериях исследований использовали ПБСП мозга как 0-1, так и 2-3 суточных новорожденных крыс, однако сравнительный анализ не выявил возрастных различий в эффектах действия глутамата на их респираторную активность.

Максимальное увеличение частоты генерации инспираторных залпов наблюдали на фоне введения глутамата в каудальную часть МВЯ почти в 2,5 раза (р<0,001; парный t - тест) по сравнению с исходным уровнем. Рост данного параметра был обусловлен как уменьшением общей продолжительности дыхательного цикла на 75,б±4,8% (р<0,001; парный t - тест), так и укорочением длительности инспираторного залпа на 32,4±2,4% (р<0,01; парный t-тест). На спектрограммах респираторных разрядов наблюдали значительное снижение амплитуды осцилляций низкочастотного диапазона на 38,2±7,3% (р<0,05; парный t-тест). Продолжительность наблюдаемых реакций составляла в среднем 1,5-2 мин, после чего показатели активности дыхательного центра возвращались к фоновым значениям, при этом латентный период не превышал 5-7 с.

В условиях микроинъекций глутамата в ЛВЯ и СВЯ сохранялась общая направленность реакции, однако выраженность инспираторно-активирующего эффекта существенно снижалась, при этом прирост частоты генерации респираторных разрядов составили, соответственно, 83,4±4,8% (р<0,05; парный t-тест) и 24,7±3,4% (р<0,05; signed rank-тест). Кроме того, в условиях воздействия L-глутамата на область ЛВЯ выявлено снижение мощности низкочастотных осцилляций (36,8±5,89 %; р<0,05; парный t-тест), тогда как спектральные характеристики респираторных разрядов на фоне микроинъекции исследуемого вещества в спинальное ядро вестибулярного комплекса не претерпевали статистически значимых изменений, что свидетельствует о преимущественном воздействии L-глутамата через структуры СВЯ на активность генератора дыхательного ритма, а не паттерна инспираторной активности. В условиях введения L-глутамата в СВЯ обнаружены также определенные отличия в динамике протекания дыхательных реакций, в частности, удлинение латентного периода реакции до 20-30 с, а также уменьшение ее длительности до 30-40 с. Все эти данные свидетельствуют о том, что СВЯ в естественных условиях играет менее значимую роль в реализации вестибуло-респираторных влияний, чем структуры латерального и каудальной части медиального вестибулярных ядер.

- is*

Hd h^ M

О

Я О я

о я (D я hrl 2

я to я о о d

о

о я о to к X

W я to л я я

S о м я

я я

ввя

"3 °N "81-03 „кпгоиояе п впгоиопд,. кпаеэ AJSi хпншээд

Применение раствора L-глутамата для локального воздействия на область верхнего субъядра вестибулярного комплекса (п=8) практически не вызывает изменений как частотно-временных показателей спонтанной активности дыхательного центра, так и спектральных характеристик инспираторных разрядов в ПБСП мозга О - 3 суточных новорожденных крыс. Отклонения отдельных параметров не превышали 5-10% (р>0,05) от исходных значений и были сравнимы с таковыми после микроинъекции в указанную структуру вестибулярного комплекса ИЦСЖ.

Заключение. В настоящей работе установлено, что глутаматергическая система вестибулярного ядерного комплекса играет важную роль в центральных механизмах регуляции спонтанной биоэлектрической активности дыхательного центра, оказывая существенное влияние на функциональное состояние генератора респираторного ритма и структуры, ответственные за формирование респираторного паттерна. При этом сравнительный анализ респираторных реакций на микроинъекции L-глутамата в различные функционально-специфические отделы вестибулярного ядерного комплекса показал, что основная роль в механизме регуляции ритмической активности дыхательного центра у новорожденных крыс принадлежит глутаматергической системе нейронов рострального и каудального отделов медиального вестибулярного ядра и, в меньшей степени, латерального и спинального ядер вестибулярного комплекса.

ТАТАРНИКОВ Валерий Станиславович - кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры физиологии с курсом безопасности жизнедеятельности и медицины катастроф ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 443099, Самара, ул. Чапаевская, д. 89.

ПЯТИН Василий Фёдорович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой физиологии с курсом безопасности жизнедеятельности и медицины катастроф ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 443099, Самара, ул. Чапаевская, д. 89.

Глазкова Е.Н. Сравнительный анализ респираторных реакций на микроинъекции L-глутамата в различные структурно-функциональные отделы вестибулярного ядерного комплекса мозга новорожденных крыс in vitro / Е.Н. Глазкова, Н.Л. Тюрин, И.В, Широлапов, В.С. Татарников, В.Ф. Пятин // Вести. ТвГУ. Сер. Биология и экология. 2018. №2. С. 25-34.