Сравнительный анализ синтеза некоторых HSP в листьях растений трансгенного картофеля с геном gox при высокой температуре

Неблагоприятные факторы среды, в частности значительные изменения температуры, негативно влияют на рост и продуктивность растений, в связи с чем получение трансгенных растений с повышенной устойчивостью к действию данных стрессоров является весьма актуальным. Активные формы кислорода (АФК) являются важными сигнальными молекулами. Показано, что увеличение их содержания в клетках может приводить к повышению устойчивости растений к разным биотическим и абиотическим факторам (Wu et al., 1995). АФК могут запускать синтез ряда стрессовых белков, в том числе белков теплового шока (БТШ или Hsp, англ. ”Heat Shock Protein”), участвующих в защите клеток (Piterkova et al., 2013). Разные семейства БТШ выполняют различные функции, при этом большинство БТШ работают в клетке в качестве “молекулярных шаперонов” (Ellis, van der Vies, 1991; Vierling, 1991). Так, шаперонин Hsp60 локализован в митохондриях и участвует в импорте синтезированных в цитоплазме белков в митохондрии (Bukau, Horwich, 1998; Frydman, 2001). Конститутивно синтезируемые белки семейства БТШ70 - Hsc70 (“Heat shock cognate 70-kD”) способствуют фолдингу синтезируемых de novo белков, транспорту белков в клеточные органеллы и деградации поврежденных белков, а стресс-индуцируемые формы Hsp70 препятствуют агрегации денатурированных белков, способствуют рефолдингу и восстановлению их биологических функций (Vierling, 1991). Другое семейство БТШ - нмБТШ (sHsps) представляют собой группу молекулярных шаперонов с размером субъединиц 15-30 кД, они предотвращают денатурацию и агрегацию белков, поврежденных каким-либо воздействием (Vierling, 1991).

Увеличение содержания АФК в клетках можно вызвать не только действием внешних факторов, но и путем введения гена глюкозооксидазы gox в геном растения (Wu et al. , 1995; Sauchyn et al. , 2012). Результатом активности данного фермента является превращение β-D-глюкозы в β-D-глюконо-δ-лактон и сопряженное с ним восстановление молекулярного кислорода до пероксида водорода. Влияет ли повышение содержания пероксида водорода, вызванное действием глюкозооксидазы, на синтез БТШ, неизвестно.

В связи с этим целью данной работы было изучение синтеза БТШ в листьях картофеля с измененной экспрессией гена глюкозооксидазы gox .

MATERIALS AND METHODS

В работе использовали контрольные и трансгенные растения картофеля ( Solanum tuberosum L., сорт Скарб). Трансгенные растения картофеля были получены в ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси». Для трансформации был использован ген глюкозооксидазы высокоактивного грибного штамма Penicillium funiculosum 46.1. Агробактериальная трансформация растений проводилась векторными конструкциями pBI-L-GOX (линия LP ) и pBI-F-GOX (линия F ) с нативным геном глюкозооксидазы gox и pBI-GOX-mod (линия

MOD ) с модифицированным геном gox-mod , созданными на основе векторной плазмиды pBI121 (Sauchyn et al. , 2012; Sauchyn et al. , 2015).

Растения картофеля выращивали в вегетационных сосудах в условиях теплицы на базе Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН. Для экспериментов отбирали листья среднего яруса у растений, находящихся в фазе бутонизации. Отбор проб проводили в утреннее (9.00 ч) и дневное (15.00 ч) время. Температура воздуха в период отбора проб составляла 18-23°С утром и 35-43°С днем.

Определение содержания пероксида водорода в листьях проводили с помощью 3,3'-диаминобензидина (ДАБ) (Tarasenko et al. , 2012). Листья инфильтровали и инкубировали с ДАБ (0,2 мг/мл) в трис-ацетатном буфере (pH 5,0) в темноте при 26°С в течение 5 ч. Затем образцы помещали в 70% этанол и инкубировали при 80°С до тех пор, пока весь хлорофилл не переходил в раствор. По интенсивности коричневого окрашивания судили о содержании пероксида водорода в листьях (Thordal-Christensen et al. , 1997).

Для выделения суммарного клеточного белка образцы ткани замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Затем образцы размораживали в буфере для выделения белка (0,1 M Трис-HCl, 0,003 M ДДС-Na, 0,001 M ß-меркаптоэтанол, pH 7,4-7,6), в соотношении 1:4, добавляли 0,5-1 мМ фенилметилсульфонил-флюорид для ингибирования протеаз и растирали в фарфоровых ступках в жидком азоте. Грубые клеточные компоненты удаляли центри- фугированием при 15000 g в течение 15 мин на центрифуге Allegra 64R («Beckman Coulter», США). Белок из супернатанта осаждали трехкратным объемом охлажденного ацетона. Осадок белка растворяли в буфере для образца (0,125 M Трис-HCl, 0,008 M ДДС-Na, 0,1 M ß-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,001% бромфеноловый синий, pH 6,8), инкубировали 5 мин при 100°С, центрифугировали 15 мин при 5000 g. Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Белковый электрофорез проводили в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970) с использованием Mini-PROTEIN 3 Cell (BIO-RAD, США). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли в Таубин буфере в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell, BIO-RAD, США). Для изучения синтеза стрессовых белков в растительных клетках использовали антитела против различных групп БТШ: Hsp101 (AS07253, “Agrisera“, Швеция), Hsp70/Hsc70 (SPA-820, “StressGen”, США), Hsp60 (H1830-77B, “US Biological”, США), Hsp17.6C-1 (AS07254, “Agrisera”, Швеция), Hsp17.6C-2 (AS07255, “Agrisera“, Швеция).

RESULTS AND DISCUSSION

В работе было проанализировано 3 независимых линии LP и по 5 независимых линий F и МOD. Выявлено, что трансгенные растения не имели морфологических отличий, как между собой, так и с контрольными растениями исходного сорта Скарб.

С использованием ДАБ было показано, что содержание пероксида водорода в листьях трансгенных растений картофеля выше по сравнению с контрольными (Рис. 1). На основании проведенного анализа были отобраны растения линий LP, F и MOD, которые продемонстрировали наибольшее повышение содержания пероксида водорода в утренние часы. Из этих растений были взяты образцы листьев для выделения белков, и с помощью электрофореза и последующего иммуноблоттинга в них был изучен синтез БТШ в ответ на повышение температуры окружающей среды в дневное время.

Figure 1 . Детекция пероксида водорода в тканях листьев растений картофеля исходного сорта

( К ) и растений трансгенных по gox (линии LP, F, MOD ).

К LP F MOD

(ч)     9     15     9    15    9     15    9     15

Hsp101 ---*-=---^—------—----Hsp70/HSC70 -еев ■■■■»«»«■■■• «■■■**■■* ■■■■   -, — ■

Hsp60        —-^ »•■■»*—*•**—*#—^*w*<-'—■><——•Hsp17.6C-1 ** •• *** ШВ **• еЙ1 -—г ДЙ1Hsp17.6C-2      ——* —- —-*~ —* •—* -— ~—*

Figure 2 . Влияние повышенной температуры в дневное время суток (15 ч) на синтез некоторых БТШ в листьях растений картофеля исходного сорта ( К ) и растений трансгенных по gox (линии LP, F, MOD ).

Было показано, что содержание Hsp101, Hsp70/Hsc70 и низкомолекулярных БТШ I и II класса (Hsp17.6C-1 и Hsp17.6C-2) в листьях контрольных и трансгенных растений в утренние часы одинаково (Рис. 2). Исключение составляет образец, растений линии LP , у которого содержание Hsp17.6C-2 в утренние часы больше, чем в других образцах (Рис. 2). Содержание Hsp60 в утреннее время также было выше в листьях линии LP и линии F (Рис. 2). Содержание всех изученных БТШ значительно увеличивалось в дневные часы при повышении температуры в теплице, однако это повышение было сходным как у контрольных, так и у трансгенных линий.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что трансформация растений картофеля векторными конструкциями с нативным и модифицированным геном глюкозооксидазы gox повышает содержание эндогенного пероксида водорода, что приводит к изменению синтеза Hsp60 и Hsp17.6C-2. Однако требуется дальнейшая проверка возможного влияния увеличения эндогенного пероксида водорода на устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды.