Сравнительный анализ содержания антоцианов в различных образцах томата в связи с селекцией

Оригинальные статьи / Originalarticles УДК 635.64:581.175.11:001.8

Томат (Solanum lycopersicum L.) – наиболее популярная и наиболее часто употребляемая в пищу овощная культура. Он является источником биологически активных соединений, включая каротиноиды и полифенолы. Окраска плодов томата обусловлена наличием различных видов пигментов: хлорофиллов, каротиноидов и анто- цианов и является одним из важных признаков, используемых в селекции. Традиционно, большинство сортов и гибридов томата имеют красные плоды различных оттенков. Также имеются формы с оранжевыми, желтыми, розовыми, белыми, пестрыми, черными и фиолетовыми плодами. Черная и фиолетовая окраска формируется за счет синтеза антоцианов в результате мутаций каротиноидов биосинтез или расщепление хлорофилла [1]. Антоцианы относятся к флавоноидам – многочисленной группе растительных пигментов фенольной природы. Антоцианы, принадлежащие к семейству флавоноидов, представляют собой группу природных пигментов, представленных более чем 700 различными молекулярными структурами, отвечающие за красно-синюю окраску многих плодов и овощей [2], обладающие сильными антиоксидантными свойствами [3]. Томаты с фиолетовой окраской содержат от 11 до 23 различных видов антоцианов, в том числе 3 антоцианидина (дельфинидин, петунидин и мальвидин), связанные с одними или несколькими молекулами глюкозы, рутинозы, п-кумаровой и кофейной кислот [4,5,6].

У томата антоцианы могут обусловливать окраску кожуры и мякоти плода, соцветий, чашелистиков, плодоножки, листьев и стеблей (от слабой до очень интенсивной). Окраска частей растения (лист, стебель) заслуживает особого внимания, поскольку это адаптивные признаки. Так, антоцианы участвуют в защите фотосинтетического аппарата и цитоплазматической мембраны клетки, нейтрализуют свободные радикалы, предохраняя от их неблагоприятного воздействия, повышают эффективность усвоения фосфора и азота, позволяют растениям приспособиться к неблагоприятным условиям — избыточному УФ-излучению, засухе, экстремальным температурам [7].

Многочисленные исследования in vitro и in vivo предполагают, что антоцианы обладают свойствами, способствующими укреплению здоровья и могут играть важную роль в снижении хронических и дегенеративных заболеваний [8,9].

Известно, что антоцианы, поступающие с растительной пищей, могут предупреждать сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет II типа, артрит, ожирение, патологии зрения, различные виды рака, обладают противовоспалительным действием [10,11,12]. Эти соединения обладают обширной биологической активностью, способны проникать в мозг и модулировать его функции. При нейро-дегенеративных процессах антоцианы способствуют выживаемости нейронов. Механизмы нейропротекторного действия антоцианов связаны с их антиоксидантной, противовоспалительной, антитоксической и антиапоптотической активностью. Способность антоцианов воздействовать сразу на множество терапевтических мишеней делает их полезными для профилактики и лечения начальных стадий нейродегенеративных заболеваний [13].

Имеются сведения, что сорта томата с высоким содержанием антоцианов в плодах дольше хранятся и меньше поражаются серой гнилью ( Botrytis cinereal ) [14,15].

Изучение окраски у растений представляет интерес и в силу влияния пигментных соединений на вкусовые каче- ства употребляемых растительных продуктов. Важной особенностью таких образцов является сочетание содержания в плодах гидрофильных антоцианов и липофильных каротиноидов (у-, в-каротин, ликопин, фитоен, неуроспо-рин, неоликопин), что увеличивает их антиоксидантную активность.

А в связи с развитием производства продуктов функционального действия, обеспечивающих доступность потребителя ценными биологически активными нутриентами, селекция на создание сортов и гибридов с антоциановой окраской плодов является актуальной задачей.

Цель наших исследований: определение количественного состава фенольных соединений – антоцианов в различных образцах томата, и на их основе определение задач селекции по повышению содержания фенольных соединений.

Материал и методы

В работе изучены селекционные образцы ФГБНУ ФНЦО:Л-Ch-365, Л-IR-2080, Л-Земба, гибридная комбинация F 1 Земба х Л-Ch-365, сорт сибирского ботанического сада Bosare blue. Растения томата выращивали в условиях пленочных необогреваемых теплиц. Агротехника общепринятая. Окраску плодов определяли по шкале Бондарцева [16]. Для биохимического анализа использовали образцы, визуально различающиеся по интенсивности фиолетовой окраски. Плоды собирали с одного яруса растений в фазе технической и биологической спелости. Методы определения биохимических показателей:

Содержание сухого вещества

Содержание сухого вещества определяли гравиметрически после высушивания образцов при 50°C до постоянной массы [17].

Аскорбиновая кислота

Содержание аскорбиновой кислоты устанавливали методом визуального титрования 2,6-дихлорфенол индофенолятом натрия (реактивом Тиллманса) [18].

Полифенолы

Содержание полифенолов определяли спектрофотометрически с помощью реактива Фолина-Чиокалтеу [18]. 1 г гомогената томатов экстрагировали в течение часа при 80°С 20 мл 70% этанола. Раствор охлаждали до комнатной температуры, переносили количественно в 25 мл мерную колбу и доводили до метки 70% спиртом. Полученный экстракт перемешивали и фильтровали через складчатый фильтр. В мерную колбу на 25 мл добавляли 1 мл экстракта, 2,5 мл насыщенного раствора карбоната натрия Na 2 CO 3 и 0,25 мл разбавленного вдвое дистиллированной водой реактива Фолина-Чиокалтеу. Полученную смесь после интенсивного перемешивания доводили до метки дистиллированной водой. Через час после окончания реакции измеряли показатель поглощения раствора при 730 нм на спектрофотометре Unico 2804 UV (США). Содержание полифенолов рассчитывали по стандартной кривой, полученной с использованием 6 растворов галловой кислоты (Sigma) в интервале концентрации 0-90 мкг/мл. Результаты определения выражали в мг-экв галловой кислоты/г сухой массы (мг ГКЭ/г с.м.).

Антиоксидантная активность (АОА)

Для определения антиоксидантной активности использовали колориметрический метод [17], основанный на титровании раствора 0.01 N KMnO4 в кислой среде этанольным экстрактом томатов до обесцвечивания, свиде- тельствующего о полном восстановлении Mn+6 до Mn+2. В качестве внешнего стандарта использовали галловую кислоту. Результаты определения выражали в мг-экв галловой кислоты/г сухой массы (мг ГКЭ/г с.м.).

Нитраты

Уровень нитратов регистрировали в водных экстрактах с применением ион селективного электрода на иономере Эксперт 001 (Эконикс, Россия).

Моносахара

Содержание моносахаров определяли феррицианидным методом [20].

Содержание каротиноидов

Содержание каротиноидов устанавливали спектрофотометрически [18]. Полграмма гомогената томатов экстрагировали в фарфоровой ступке ацетоном (3х1.3 мл). К обьединенному экстракту добавляли 9 мл гексана и полученный раствор промывали дистиллированной водой до полного удаления запаха ацетона (4х30 мл). Гексановый экстракт переносили количественно в пикнометр на 10 мл и доводили до метки гексаном. Раствор фильтровали через слой безводного сульфата натрия и использовали для хроматографического разделения каротиноидов на хроматографической бумаге Ватман 3А в системе гексан-ацетон, 10:0.5 и элюирования чистых каротиноидов с хроматографической пластинки смесью гексан: ацетон, 3:0.5. Для расчета содержания β -каротина, ликопина и лютеина использовали показатели удельного поглощения: E1%1 см для β -каротина (2580 при λ = 450 нм), ликопина (3470 при λ = 474 нм) и лютеина (2560; λ = 447нм). В качестве внутренних стандартов использовали образцы β-кароти-на, лютеина и ликопина производства Sigma Inc. (Japan).

Содержание антоцианов

Содержание антоцианов определяли прямым спектрофотометрическим методом по величине поглощения при 550 нм экстракта образцов в 1% HCl [18]. Один грамм гомогената кожуры томатов растирали в фарфоровой ступке с 10 мл 1% соляной кислоты. Полученную смесь фильтровали через складчатый фильтр и определяли величину поглощения полученного раствора при 550 нм. Содержание суммы антоцианов в пересчете на цианидин-3,5-дигликозид в абсолютно сухом сырье в процентах (X) вычисляли по формуле

Х = (D510 х V х 100) : 453 m, где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

• V – общий,

453 — удельный показатель поглощения цианидин-3,5-дигликозида в 1% растворе соляной кислоты;

• m — масса сырья в граммах.

В селекционной работе руководствовались методическими рекомендациями по селекции томата (1986) [20]. Сахаро-кислотный индекс плодов определяли отношением сахара к кислоте. Гармоничное сочетание сахаров и кислоты обуславливает вкус и качество плодов томата. Оптимальное отношение сахара и кислоты (сахарокислотный индекс) должно находиться в пределах 6-8 единиц [21]. Дегустационная комиссия оценивала плоды по 5 бальной шкале.

Статистика

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием статистической программы Excel

Результаты исследований и их обсуждение

Анализ литературных данных показывает, что на протяжении многих лет имеется интерес к селекции томата на повышенное содержание антоцианов. Проводится она во многих странах мира различными методами.В США селекционер Джим Майерс с коллегами использовали межвидовые гибриды между Solanum chilense и S. сheesmaniae , добившись резкого увеличения экспрессии пигмента. Результатом этой работы стало создание сорта Индиго Роуз,кото-рый содержит от 10 до 30 мг антоцианов на 100 г свежих плодов. В настоящее время в Соединенных Штатах имеется более 20 коммерческих сортов с фиолетовой окраской плодов, большинство из которых выведены из оригинальных линий, созданных Майерсом [23]. Для получения сортов и гибридов томата с фиолетовой окраской плодов использовались и трансгенные подходы для модификации биосинтеза фенилпропаноидов [24]. Для повышения уровня флавоноидов в плодах экспрессировали гены факторов транскрипции кукурузы LC и C1 в плодах генетически модифицированных растений томата,что способствовало их накоплению в мякоти плодов,где обычно не продуцируются флавоноиды [25]. Также экспрессировали два фактора транскрипции из львиного зева в томат,плоды растений накапливали антоцианы на уровнях сопоставимых с уровнями антоцианов, обнаруженными в ежевике и чернике [25]. Однако, несмотря на значительный успех в увеличении содержания флавоноидов путем трансгеноза, последние 15 лет наблюдается растущий интерес к селекции томата с высоким содержанием флавоноидов без ГМО [27].

В ФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства» селекция томата на повышенное содержание антоцианов в плодах проводится классическими традиционными методами. При создании нового сортимента учитываются потребности рынка,которые реализуются в виде селекционных моделей создаваемых сортов и гибридов.В данной селекционной программе стоит задача создания гибридов томата с высоким содержанием антоцианов.

Биохимический состав плодов томата зависит от многих факторов: условий выращивания, агротехники, степени зрелости плодов, но основным фактором является генотип. Проведенные исследования показывают, что между изучаемыми образцами томата имеются значительные различия,как по морфологическим признакам,так и по биохимическим показателям (табл. 1, 2). Растения различались по габитусу, антоциановой окраске листа, венчика соцветия, плодоножки и плода. Ткани стебля и листа у образцов с антоциановыми плодами имели более темную окраску по сравнению с образцами красноокрашенными. При проведении опытов было отмечено,что плоды томата достаточно быстро синтезируют антоцианы под действием света, что подтверждается их интенсивной окраской как в бланжевой (технической) спелости, так и при полном созревании.Антоцианин отсутствовал в областях, затененных чашечкой, наиболее интенсивная окраска была в кожице и околоплодниковых тканях под ней.Внутренняя часть плода не содержала видимого антоцианина.

Таблица 1. Тип растения и присутствие антоциановой окраски на частях растения (2021-2022 годы) Table 1. The type of plant and the presence of anthocyanin coloration on parts of the plant (2021-2022)

Образец	Растение	Окраска
		лист	чашечка	кожуры плода		мякоти плода
				бланжевая спелость	биологическая спелость	бланжевая спелость	биологическая спелость
Земба	индетерминантное, стебель с антоцианом	тёмно-зелёный с сильным антоцианом	средний антоциан	насыщенно фиолетовая с желтизной	фиолетовокрасная	желтоватозеленоватая	красно коричневая
Л-Ch-365	индетерминантное, стебель с антоцианом	тёмно-зелёный с сильным антоцианом	средний антоциан	фиолетовая	фиолетовокрасная	желтоватозеленоватая	темно-красная
F 1 Земба х Л-Ch-365	индетерм., стебель с антоцианом	тёмно-зелёный с сильным антоцианом	средний антоциан	темно фиолетовая	фиолетовокрасная	желтоватозеленоватая	темно-красная
Л-IR-2080	индетерминантное, стебель с небольшим антоцианом	тёмно-зелёный с небольшим антоцианом	сильный антоциан	желтовато фиолетовая	коричнево красная	желтовато зеленоватая	розово-коричневая
Bosare blue	индетерминантное, стебель с небольшим антоцианом	зеленый с небольшим антоцианом	слабый антоциан	фиолетовосиреневая	фиолетовокрасная	желтоватозеленоватая	розово-коричневая

Все изучаемые образцы различались по содержанию антоцианов в кожуре плода, общее их накопление регистрировалось в пределах 6,1-16,3 мг/100 г. Наибольшее содержание антоциана отмечено у Л-Земба (16,3), так как отбор по интенсивности окраски плодов проводился на протяжении 5 лет. У гибрида с участием этой линии F1 Земба х Л-Ch-365 (15,1) также отмечено высокое содержание антоцианов, что свидетельствует о перспективности селекции на данный признак. В целом, несмотря на известные значительные вариации в накоплении антоцианов черными томатами, результаты настоящего исследования находятся в хорошем соответствии с известными литературными данными [14, 28]. Генетические особенности биосинтеза антоцианов в плодах томата являются темой отдельного исследования. У изученного материала выявлена фенотипическая зависимость между окраской плодов и содержанием антоцианов в кожуре, что можно использовать при селекционном отборе. Важной особенностью таких плодов является сочетание в них наряду с антоцианами липофильных каротиноидов (β-каротин, ликопин и др.), что существенно усиливает эффективность их совместной антиоксидантной активности. Более высокое содержание ликопина отмечено у образцов с менее интенсивной окраской плода: Л-IR-2080 (11,6 мг/г) и Bosare blue (9,0 мг/г), у этих образцов и наибольшая сумма каротиноидов. Содержание аскорбиновой кислоты в плодах не зависело от интенсивности антоциановой окраски плода. Наиболее высокое содержание отмечено в образцах Bosare blue, Л-IR-2080. Все биохимические показатели по содержанию биологически активных веществ влияют на общую антиоксидантную способность. Наиболее высокая общая антиоксидантная активность отмечена у сорта Bosare blue (1,5 мг-экв ГК/г с.м.) и гибридной комбинации F1 Земба х Л-Ch-365 (1,47 мг-экв ГК/г с.м.)

Таблица 2. Биохимические показатели изучаемых образцов Table 2. Biochemical parameters of the studied samples

Показатели	Л-Земба	Л-Ch- 365	F1 Земба х Л-Ch-365	Л-IR-2080	Bosare blue
Сухое вещество, %	9,6±0,1ab	6,0±0,6c	8,15±0,8b	9,7±0,9 ab	11,0±1,1a
Антоцианы, мг/100 г	16,3±1,6a	10,3±1,0b	15,1±1,5a	13,5±1,4a	6,1±0,6с
Нитраты, мг/кг	153±15a	105±10b	135±14a	70±7c	154±15a
Сахара, %	4,9±0,5b	2,5±0,2c	4,2±0,4b	4,9±0,5b	6,2±0,6a
АОА*	1,38±0,1b	1,07±0,1c	1,47±0,1ab	1,34±0,1b	1,50±0,2a
ТР*	1,31±0,1a	0,85±0,1b	1,22±0,1a	1,23±0,1a	1,36±0,1a
АК**	31,6±3,2b	22,6±2,3c	30,1±3,0b	35,8±3,6ab	39,9±4,0a
β-каротин***	0,52±0,05bc	0,56±0,05bc	0,46±0,05c	0,74±0,07a	0,50±0,05b
Ликопин***	4,6±0,5d	5,4±0,5d	7,1±0,7c	11,6±1,2a	9,0±0,9b
Лютеин***	1,7±0,2ab	2,0±0,2a	1,9±0,2a	1,6±0,2b	1,5±0,1b
Сумма каротиноидов	6,82±0,7d	7,96±0,8cd	9,46±0,9c	13,94±1,4a	11,00±1,1b

*мг-экв ГК/г с.м., ** мг/100 г сырой массы*** мг/г

Значения в рядах с одинаковыми индексами статистически не различаются согласно тесту Дункана при p<0.05

Таблица 3. Изменение содержания антоцианов в процессе созревания плодов Table 3. Changes in the content of anthocyanins during fruit ripening

Сортообразец / стадия созревания	Линия L-IR			Земба
	крупный сформированны й плод	бланжевый	биологическая спелость	крупный сформированны й плод	бланжевый	биологическая спелость
Окраска плода	темнофиолетовая	желтоватофиолетовая	коричневокрасная	зеленоватофиолетовая	насыщенно фиолетовая с желтизной	фиолетовокрасная
Антоцианы, мг/100 г	9,24±0,9b	6,30±0,6c	8,54±0,8b	5,96±0,6c	11,47±1,1a	10,26±1,0ab
Антоцианы, мг/100 г сухого вещества	88±8,8b	64,3±6,4c	90,8±9,0ab	54,2±5,4c	107,2±10,7a	95,0±9,5ab

Значения в рядах с одинаковыми индексами статистически не различаются согласно тесту Дункана при p<0.05

Учитывая важность признака антоциановой окраски плодов необходимо провести поиск возможных взаимосвязей чтобы на ранних этапах онтогенеза провести селекционные отборы на повышенное содержание пигментных веществ фенольной природы.

Учитывая тот факт, что сорта с антоциановой окраской в основном выращиваются в защищенном грунте, где сбор плодов чаще проводят в стадии крупного зеленого или бланжевого плода для лучшего хранения и транспортировки, изучение изменения содержания биологически активных веществ, в том числе и антоцианов, на разных стадиях формирования и созревания плодов важно при селекции. А поиск источников и создание исходного материала с высокими показателями антоцианов на разных стадиях созревания от зеленого, бланжевого до биологической спелости имеет важное значение для селекции. Для решения этой задачи в нашей работе проведено изучение содержания антоцианов в динамике от формирования крупного плода до полного созревания. Полученные результаты свидетельствуют, что отбор на высокое содержание можно проводить на различных этапах созревания плодов, отбирая наиболее насыщенную окраску (табл.3). А сбор плодов в тепличных комбинатах в стадии крупного сформированного или бланжевого плода не снизит качество полученной продукции, так как содержание антоцианов на данных стадиях развития находилось в пределах ошибки опыта или несколько отличалось от показателей биологической спелости. Созданный в ФНЦО сорт Земба имел достаточно высокие показатели содержания антоцианов.

Для оценки вкусовых качеств плодов, наосновании результатов анализа, были рассчитаны сахаро-кислотные индексы,

Таблица 4. Сахаро-кислотный индекс и дегустационная оценка плодов томата Table 4. Sugar-acid index and tasting evaluation of tomato fruits

Сортообразец Сахаро-кислотный индекс Дегустационная оценка Л-Земба 8,8 4,8 Л-Ch- 365 7,2 4,5 F1 Земба х Л-Ch-365 7,5 4,6 Л-IR-2080 8,5 4,6 Bosare blue 9,1 5,0 а также проведена дегустационная оценка плодов изучаемых образцов (табл.4). Сахаро-кислотный индекс плодов определяли отношением сахара к кислоте. Дегустационная комиссия оценивала плоды по 5 бальной шкале.

По результатам анализа и органолептической оценки лучшими вкусовыми качествами обладали образцы: Bosare blue, Л-Земба. Их можно рекомендовать для использования в качестве исходного материала для селекции.

Рис. 1. Cорт томата Земба Fig. 1. Tomato variety Zemba