Сравнительный анализ влияния адреноблокаторов в условиях органотипического культивирования ткани кости

Распространённость остеопороза в мире приобретает характер эпидемии. Как правило, остеопороз развивается на фоне уже имеющейся патологии или формируется в результате применения лекарственных препаратов. Выявление общих патогенетических механизмов, лежащих в основе сочетанных патологий, и путей их фармакокоррекции является актуальным направлением для практического здравоохранения.

Особый интерес представляет развитие остеопороза на фоне сердечно-сосудистых заболеваний. Доказано, что повышение тонуса симпатической нервной системы играет важную роль в развитии артериальной гипертензии [2], а также коррелирует со снижением костной массы, за счет стимуляции остеокластогенеза и процессов резорбции ткани [11]. В связи с этим тонус симпатической нервной системы может рассматриваться как общее звено в патогенезе сердечнососудистых заболеваний и остеопороза.

Ряд клинических исследований демонстрирует увеличение минеральной плотности кости и снижение риска развития переломов у пациентов с артериальной гипертензией, получающих терапию адреноблокаторами [12, 14]. Селективные адреноблокаторы проявили более выраженный протективный эффект [8]. В других исследованиях не обнаружено положительного влияния адреноблокаторов на костную ткань [6]. Противоречивые данные могут быть связаны с различным дизайном исследований и наличием неучтенных факторов риска переломов (индекс массы тела, физическая активность, возраст, хронические заболевания, сопутствующая терапия).

Остается открытым вопрос, является ли возможное остеопротективное действие адреноблокаторов результатом прямого влияния на остеобласты или оно опосредовано системными эффектами.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Проанализировать действие селективного и неселективного β-адреноблокаторов на рост клеток ткани кости в норме и на фоне высокой концентрации адреналина.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводили на эксплантатах ткани кости 10–12-дневных куриных эмбрионов. Каждая серия экспериментов включала 120 контрольных эксплантатов и 120 экспериментальных эксплантатов на каждую исследованную концентрацию действующих веществ. Выделение и культивирование эксплантатов производили по методу, описанному ранее [3]. В питательную среду экспериментальных эксплантатов добавляли пропранолол (10^-10 М – 10^-4 М), метопролол (10^-10 М – 10^-4 М), адреналин (10^-4 М). Клетки зоны роста контрольных и экспериментальных эксплантатов окрашивали антителами ab3442 к β 1 -адренорецептору (1:400) и Т6778 (1:300) по стандартному протоколу.

Полученные изображения анализировали при помощи программы ImageJ. Для количественной оценки степени роста эксплантатов применяли морфометрический метод. Морфометрический критерий индекс площади (ИП) рассчитывали как отношение общей площади эксплантата к площади исходной зоны. Значение ИП контрольных эксплантатов принимали за 100 %. Часть исследования выполнена на оборудовании Центра коллективного пользования «Конфокальная микроскопия» Института физиологии им. И. П. Павлова РАН. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA 10.0. Использовали t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок. Различия считались достоверными при р ˂ 0,05. Результаты представлены в виде среднее арифметическое ± стандартное отклонение (M ± σ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для доказательства наличия β 1 -адреноре-цепторов и их визуализации на поверхности клеток в зоне роста, эксплантаты ткани кости окрашивали антителами к β 1 -адренорецептору. Рецепторы расположены по всей поверхности плазматической мембраны (рис. 1).

Действие неселективного β -адрено-блоктора пропранолола (10^-10 М до 10^-4 М) на рост эксплантатов ткани кости в органотипической культуре было дозозависимым (рис. 2). В концентрации 10^-10 М и 10^-8 М пропранолол практически не оказывал влияния на рост экспериментальных эксплантатов, ИП не отличался от контрольного значения. В концентрации 10^-6 М пропранолол ингибировал рост эксплантатов исследуемой ткани на (45 ± 1,2) % (n = 120, p ˂ 0,05). Пропранолол практически полностью ингибировал рост экспериментальных эксплантатов в дозе 10^-4 М (рис. 2).

Рис. 1. Распределение β 1 -адренорецепторов в клетках зоны роста эксплантатов ткани кости. Контроль.

Окр. антителами к β 1 -адренорецептору (ув. ×40).

Рис. 2. Дозозависимое действие неселективного β -адреноблокатора пропранолола на рост эксплантатов ткани кости, * – p ˂ 0,05, ** – p ˂ 0,01, достоверные различия относительно контрольного значения

Действие селективного β 1 -адреноблокатора метопролола также оказалось дозозависимым (рис. 3). Препарат (10^-8 М и 10^-6 М) угнетал рост эксплантатов ткани кости на (22 ± 1,8) % (n = 120, p ˂ 0,05) и (23 ± 1,4) % (n = 120, p ˂ 0,05) соответственно. В концентрации 10^-4 М метопролол угнетал рост эксплантатов на (45 ± 1,1) % (n = 120, p ˂ 0,05).

В следующей серии экспериментов оценивали влияние адреноблокаторов на рост эксплантатов ткани кости на фоне высокой концентрации адреналина (10-4 М), оказывающей остеоингибирующее действие.

Добавление метопролола (10-10 М) в питательную среду не устраняло остеоингибирующий эффект адреналина (10-4 М), ИП экспери- ментальных эксплантатов был ниже контрольного значения на (48 ± 1,3) % (n = 120, p ˂ 0,05) и не отличался от ИП эксплантатов, культивируемых в питательной среде содержащей только адреналин.

Культивирование эксплантатов ткани кости в питательной среде, содержащей адреналин (10-4 М) и пропранолол, показало, что добавление пропранолола в культуральную среду нивелирует ингибирующий эффект адреналина (рис. 4).

ИП экспериментальных эксплантатов составил (86 ± 2) % (n = 120) от контрольного значения. Отличие от ИП эксплантатов, культивируемых в питательной среде, содержащей один адреналин, составило (38 ± 1,3) % (p ˂ 0,05).

■ Контроль D Метопролол Концентрация, М

Рис. 3. Влияние селективного β 1 -адреноблокатора метопролола на рост эксплантатов ткани кости 10–12-дневного куриного эмбриона, * – р < 0,05, достоверные различия относительно контрольного значения

Рис. 4. Пропранолол (10^-10 М) устраняет ингибирующий рост эксплантатов ткани кости эффект адреналина (10^-4 М): * – p ˂ 0,05, достоверные различия относительно контрольного значения, # – p ˂ 0,05, достоверные различия относительно ИП эксплантатов, культивируемых в среде в присутствии адреналина (10^-4 М)

Долгое время считалось, что клетки ткани кости животных и человека экспрессируют только β 2 -адренорецепторы. Экспрессия β 1 -адрено-рецеп-торов была описана только на клетках линий SaOS-2, TE-85, OHS-4 и связывалась с низкой дифференцировкой исходных клеток [7]. Khosla с соавт. проанализировали экспрессию всех подтипов β -адренорецепторов в образцах биопсии ткани кости и первичной культуре остеобластов человека и обнаружили уменьшение экспрессии рецепторов в ряду β 2 >  β 1 >>  β 3 [8]. В условиях органотипической культуры ткани нами доказано наличие β 1 -адренорецепторов на поверхности клеток зоны роста эксплантатов ткани кости 10–12-дневных куриных эмбрионов.

Блокаторы широко применяются в клинической практике для лечения артериальной гипертензии. Родоначальник группы β -адрено-блока-торов – пропранолол был синтезирован в 1962 г. Именно он является препаратом сравнения для лекарственных средств, относящихся к данной группе. Некоторые адреноблокаторы обладают помимо основного β -адренобло-кирующего действия рядом дополнительных эффектов: наличием внутренней симпатомиметической активности, α -адреноблокирующего действия, мембраностабилизирующего и вазодилатирующего эффектов [1]. Другие β -адре-ноблокаторы являются частичными или обратными агонистами адренорецепторов.

Пропранолол является полным антагонистом β-адренорецепторов и не способен их активировать или проявлять свойства обратного агониста. Обнаружено, что пропранолол может акти- вировать внеклеточную сигнал-регулируемую киназу 1/2 (ERK 1/2), запускать сигнальные каскады и транскрипцию генов через механизмы, не связанные c активацией Gs/i-белков [5]. Экспериментальные данные, полученные Patrizio с соавт. с использованием культуры кардиомиоцитов новорожденных мышей, доказали способность пропранолола (25×10-6 М) активировать экспрессию гена Erg1 (принимающего участие в регуляции клеточного цикла и дифференцировки клеток) через β-адренорецеп-торы. Причем механизм регуляции экспрессии генов не зависит от способности пропранолола блокировать эффект катехоламинов [9]. Исследование системного введения низких доз пропранолола (0,1 мг/кг) на регенерацию кости после переломов не обнаружило положительного или отрицательного действия препарата на заживлении остеотомии у крыс и механическую прочность кости [10]. При локальном введении препарата в места остеотомии с использованием скаффолдов, обеспечивающих длительное высвобождение пропранолола (0,12 × 10-6 М и 2,18 × 10-6 М), зарегистрировано усиление остеогенеза, миграции стволовых клеток и снижение остеокластогенеза [13]. В условиях органотипического культивирования мы не обнаружили стимулирующее рост ткани кости действие пропранолола в диапазоне концентраций от 10-4 М до 10-10 М.

Метопролол относится к липофильным селективным β1-адреноблокаторам без внутренней симпатомиметической активности. В работе Zang с соавт. введение метопролола в культуру первичных остеобластов новорожденных крысят (10-9 М – 10-7 М) увеличивало пролиферацию остеобластов, активность щелочной фосфатазы и минерализацию кости. Максимальный эффект наблюдался в концентрации 10-7 М через 7 суток культивирования. В модели in vivo у крыс после овариоэктомии при пероральном введении метопролола (150 мг/кг и 250 мг/кг) сохранялись биомеханические свойства и минеральная плотность костной ткани [15]. Мы не обнаружили стимулирующего рост ткани кости действия препарата в диапазоне концентраций от 10-10 М до 10-4 М. Различие результатов может быть связано с большей чувствительностью эмбриональной ткани и меньшим сроком культивирования. Ранее в аналогичных экспериментальных условиях зарегистрировано ингибирующее рост эксплантатов ткани сердца действие метопролола [4]. Так же, как и при культивировании эксплантатов ткани сердца, метопролол ингибировал рост эксплантатов ткани кости в диапазоне концентраций от 10-8 М до 10-4 М.

Поскольку известно, что повышение тонуса симпатической нервной системы и увеличение содержания катехоламинов в плазме крови является одним из факторов развития сердечнососудистых заболеваний, ранее в условиях органотипического культивирования было исследовано влияние адреналина (10^-14 М – 10^-4 М) на рост эксплантатов ткани кости 10–12-дневных куриных эмбрионов [3]. Адреналин не оказывал трофо-тропного действия на рост эксплантатов ткани кости. В концентрации 10^-4 М препарат угнетал рост эксплантатов на 53 %. Введение в питательную среду атенолола (10^-4 М) не устраняло остеотоксическое действие адреналина [3]. Аналогичным образом добавление в питательную среду метопролола (10^-10 М) не устраняло остеоингибирующий эффект адреналина. Культивирование эксплантатов ткани кости в питательной среде, содержащей неселективный β -адреноблокатор пропранолол (10^-10 М) и адреналин, приводило к нивелированию остеоингибирующего действия катехоламина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в условиях органотипического культивирования, исследованные адреноблокаторы не оказывали прямого стимулирующего рост клеток ткани кости действия.

Остеопротективный эффект пропранолола был обнаружен на фоне высокой концентрации адреналина.

Работа поддержана субсидией молодым ученым, молодым кандидатам наук вузов, отраслевых и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга в 2019 г.