Среднесмертельные дозы ЛД50 ядовитого секрета гадюк и масса экспериментальных животных

Определение среднесмертельной дозы ЛД 50 ядовитых веществ (в том числе и ядовитого секрета змей) предполагает построение зависимости эффекта воздействия яда (летальности экспериментальных животных) от количества

вводимого ядовитого секрета (Беленький, 1963). ЛД50, выраженная в мкг/г (или мг/кг), отражает ту дозу яда, при которой наблюдается гибель 50% экспериментальных животных. Определение ЛД50 яда гадюк в «классическом» варианте предполагает инъекцию раствора ядовитого секрета в возрастающих дозах экспериментальным животным одинаковой массы, сформированным в группы, и на каждой группе животных анализируют одну дозу яда (Гелашвили и др., 2015). В токсинологическом эксперименте по определению ЛД50 необходимо использовать животных одинаковой массы, одного пола, содержащихся в одинаковых усло- виях (режим кормления, температура и. т.п.). В частности, в экспериментах на мышах рекомендовано использовать мышей-самцов массой 20,0±1,0 г. При таком подходе сводятся к минимуму и половые различия, и различия, обусловленные онтогенетическими особенностями. Ранее было показано на ядовитом секрете четырех подвидов гадюк (V. b. berus, V. b. nikolskii, V. r. renardi, V. r. bashkirovi), что в наших экспериментальных условиях самцы и самки мышей обладают одинаковой устойчивостью к их яду (Горелов, 2018). Значения ЛД50 яда восточных степных гадюк, определенные на самцах и самках банановых сверчков, также не имеют статистически значимых различий (Ма-ленёв и др., 2016). Поэтому цель настоящего исследования – выявить возможную зависимость значений ЛД50 ядов обыкновенной и восточной степной гадюк от массы экспериментальных животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ядовитый секрет гадюк. Объединенные образцы ядовитого секрета обыкновенной V. berus и восточной степной V. renardi гадюк из разных локалитетов на территории Волжского бассейна были получены ранее (2013-2017 гг.) в ходе плановых экспедиций. Все процедуры получения ядовитого секрета проводили в лаборатории стандартными методами (Маленёв и др., 2014). Выбор именно этих образцов ядовитого секрета гадюк был обусловлен тем, что их количества было достаточно для проведения серии токсинологических экспериментов.

Сверчки. В экспериментах по определению ЛД50 на насекомых использовали культуру банановых сверчков Gryllus assimilis, которых содержали и разводили в лаборатории. В экспериментах использовали водный раствор яда в концентрации 2,0 мг/мл, и определение ЛД50 яда гадюк проводили на группах сверчков массой 0,40-0,49, 0,50-0,59, 0,60-0,69 и 0,70-0,79 г, в которых присутствовали и самцы, и самки сверчков. На каждой весовой группе было проанализировано 6 доз яда (5-10-20-30-40-60 мкг/г) по 5 сверчков для каждой дозы (таблица). Водные растворы яда вводили сверчкам внутрибрюшинно с помощью микрошприца (130 мкл) в правую нижнюю четверть брюшка с дорзальной стороны.

Таблица

Характеристика гадюк, от которых получен яд, и экспериментальных животных

Вид гадюк	Место отлова гадюк	Экспериментальные животные	Пол экспериментальных животных	Масса животных в группе, г	n
V. renardi	Волгоградская обл., Камышинский р-н, окрестности с. Верхняя Добринка	банановые сверчки	самцы и самки	0,40-0,49	30
				0,50-0,59	30
				0,60-0,69	30
				0,70-0,79	30
V. berus	Новгородская обл., Боровичский р-н, окрестности с. Опеченский посад	озерные лягушки	самцы и самки	1,6-2,0	30
				2,1-2,5	30
				3,6-4,0	30
V. renardi	Волгоградская обл., Камышинский р-н, окрестности с. Верхняя Добринка			1,6-1,8	25
				2,6-3,0	25
				3,6-4,0	25
V. berus	г. Самара, Красноглинский р-н	лабораторные мыши	самцы	14,0-16,5	12
				19,5-21,0	12
				25,0-29,0	12
			самки	14,0-16,5	12
				19,5-21,0	12
				25,0-29,0	12

Лягушки. Для определения ЛД 50 ядов гадюк для земноводных использовали сеголетков озерной лягушки Pelophylax ridibundus , которые были отловлены в пойме р. Ахтуба (Красноярский район Астраханской области, окрестности ст. Досанг) в конце августа – начале сентября 2013 г. (Маленёв и др., 2013).

Ядовитый секрет обыкновенных гадюк ана- лизировали на лягушках трех групп с массой 1,6-2,0 г, 2,0-2,5 г и 3,6-4,0 г. Водный раствор яда использовали в концентрации 5,0 мг/мл, и в каждой весовой группе анализировали 6 доз (510-20-40-60-80 мкг/г) по 5 лягушек для каждой дозы (таблица).

Определение ЛД 50 яда восточных степных гадюк проводили на лягушках массой 1,6-1,8 г,

2,6-3,0 г и 3,6-4,0 г. В каждой весовой группе было проанализировано 5 доз яда (5-10-15-2030 мкг/г), также по 5 лягушек (таблица). Водные растворы яда вводили лягушкам внутрибрюшинно в правую нижнюю четверть брюшка с вентральной стороны.

Мыши. Белых лабораторных мышей Mus musculus содержали и разводили в виварии в стандартных клетках для мелких грызунов. В экспериментах использовали группы мышей (отдельно самцов и самок) с массами 14,0-16,5, 19,5-21,0 и 25,0-29,0 г. Яд растворяли в физиологическом растворе до концентрации 3,0 мг/мл и анализировали 4 дозы (0,5-1,0-2,0-3,0 мкг/г) по 3 мыши в каждой группе (таблица). Раствор ядовитого секрета вводили мышам также внутрибрюшинно в правую нижнюю четверть брюшка с вентральной стороны.

Токсикометрия. Наблюдения за животными проводили в течение 24 часов после инъекции яда, после чего подсчитывали количество погибших и выживших животных. В качестве контроля использовали группы животных, которым вместо раствора яда вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. В наших экспериментальных условиях все животные контрольных групп оставались живыми в течение времени наблюдения. Эксперименты по токсикометрии проводили при комнатной температуре (22-25°С).

Пробит-анализ . Для каждой весовой группы разных видов экспериментальных животных значение среднесмертельной дозы ЛД 50 рассчитывали методом модифицированного про-бит-анализа (Безруков и др., 1995) и выражали в мкг яда/г массы тела. Достоинство данного метода заключается в том, что с его помощью можно рассчитать не только среднее значение ЛД 50 , но и ошибку средней ( M ± m ), а также провести сравнительный анализ токсичности разных образцов яда. Сравнение значений среднесмертельных доз проводили методами параметрической статистики с использованием t -критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

Рис. Значения ЛД50, определенные на экспериментальных животных разной массы

(А – сеголетки озерной лягушки, ядовитый секрет Vipera berus ; Б – сеголетки озерной лягушки, ядовитый секрет V. renardi ; В – банановые сверчки, ядовитый секрет V. renardi ; Г – самцы и самки лабораторных мышей, ядовитый секрет V. berus )

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты определения ЛД 50 ядов гадюк на экспериментальных животных разной массы тела представлены на рисунке (А, Б, В, Г). В диаграммах приведены средние значения ЛД 50 и их 95%-ные доверительные интервалы. Данные виды экспериментальных животных выбраны по той причине, что в природе они являются пищевыми объектами гадюк – в частности, мышевидные грызуны входят в состав рациона обоих видов гадюк, прямокрылые насекомые составляют значительную часть рациона восточных степных гадюк, а земноводные являются пищевыми объектами обыкновенных гадюк (Bakiev u.a., 2005; Бакиев и др., 2008а, б, 2015).

Как видно из представленных диаграмм, наблюдается общая тенденция – чем больше масса животных в группе, тем меньше абсолютное значение ЛД50, т.е. с увеличением массы животных в группах экспериментально определенные значения ЛД50 снижаются. Это отмечено для ядовитого секрета обоих видов гадюк и трех разных видов экспериментальных животных (рисунок). Но при сравнении значений ЛД50 яда, определенных на животных одного вида разной массы, статистически значимых различий выявить не удалось – отмеченные на диаграмме доверительные интервалы средних значений ЛД50 перекрываются.

Тем не менее, полученные результаты позволяют сформулировать замечания, которые следует учитывать на практике при планировании и проведении токсинологических экспериментов: увеличение массы животных в испытуемых группах приводит к некоторому занижению значений ЛД 50 в опыте, а расширение диапазона масс животных в группах приводит к увеличению ошибки при экспериментальном определении ЛД 50 .

ВЫВОДЫ

Представленные выше результаты определения среднесмертельных доз ЛД 50 ядовитого секрета обыкновенной и восточной степной гадюк свидетельствуют о наличии общей тенденции снижения значений ЛД₅₀ при увеличении массы экспериментальных животных. Данная тенденция отмечена для всех рассмотренных видов экспериментальных животных (сверчки, лягушки, мыши). При этом статистически значимых различий при сравнении величин ЛД 50 , определенных на животных одного вида разной массы, на имеющемся экспериментальном материале нам выявить не удалось.

Авторы выражают признательность А.Г. Бакиеву и А.А. Клёниной за помощь в сборе материала и консультации.