SSR-анализ плюсовых деревьев сосны обыкновенной из Республики Марий Эл

При реализации селекционных программ необходимо сохранять генетическую изменчивость древесных растений, так как она обеспечивает популяциям возможность противостоять биотическим и абиотическим факторам в меняющихся климатических условиях [1]. Из-за длительности жизненного цикла процесс селекции у хвойных видов занимает достаточно большой период времени, поэтому важно уже на этапе отбора плюсовых деревьев проводить оценку их генетического разнообразия. Исследования генетического разнообразия клонов плюсовых деревьев, а также лесосеменных плантаций, созданных их потомством, зачастую демонстрируют противоречивые результаты. Существует мнение, что использование ограниченного количества плюсовых деревьев является основной причиной потери аллельного разнообразия [2]. Действительно, для ряда лесосеменных плантаций выявлено снижение числа аллелей у изоферментных и микросателлитных локусов по сравнению с естественными насаждениями [3–6]. Однако в других публикациях приводятся данные, показывающие, что отбор плюсовых деревьев не приводит к снижению генетического разнообразия[7–9].

Для решения разнообразных научных задач в области лесного селекционного семеноводства одним из наиболее востребованных типов молекулярных маркеров являются микросателлиты (или SSR-маркеры) [10]. Они представляют собой короткие тандемно повторяющиеся последовательности длиной 2–4 нуклеотида [11]. Большую востребованность данного типа ДНК-маркера обеспечивают такие преимущества, как высокий полиморфизм, кодоминантный тип наследования, высокие частота встречаемости в геноме и воспроизводимость метода [12]. Для изучения ядерных микросателлитных локусов сосны обыкновенной ( Pinus sylvestris ) разработаны и протестированы специфические праймеры [13–15].

На сегодняшний день в Республике Марий Эл числится 192 плюсовых дерева сосны обыкновенной. Плюсовые деревья отобраны в контрастных почвенно-экологических условиях – от песков до суглинков. В рамках организации лесного семеноводства на принципах плюсовой селекции на территории Сернурского лесничества с 1994 по 1997 г. созданы следующие объекты лесного семеноводства сосны обыкновенной: маточная плантация на площади 6 га, 2 клоновые лесосеменные плантации 1-го порядка на общей площади 51 га и испытательные культуры плюсовых деревьев на площади 0,5 га. Однако до настоящего времени работы по изучению генетического разнообразия данных объектов с использованием микросателлитов не проводили.

Цель исследования – изучение генетического разнообразия плюсовых деревьев сосны обыкновенной в разных типах лесорастительных условий (ТЛУ) на основе анализа ядерных микро-сателлитных локусов.

Объект и методы исследования

Объекты исследования – клоны плюсовых деревьев сосны обыкновенной, произрастающие на маточной плантации (коллекционно-маточном участке) Сернурского лесничества Республики Марий Эл. Маточная плантация заложена в 1994 г. посадкой привитых саженцев с размещением 5x5 м. Саженцы для создания плантации получены путем прививки способом «в приклад сердцевиной на камбий». Для оценки генетического разнообразия плюсовых деревьев заготовлены образцы с 71 клона, из которых 24 являются вегетативным потомством плюсовых деревьев, отобранных в ТЛУ А2 (свежая песчаная почва), 33 клона – в ТЛУ А3 (влажная песчаная почва) и 14 клонов – в ТЛУ С2 и С3 (свежие и влажные суглинистые почвы).

ДНК для генетического анализа выделена из камбиального слоя СТАВ-методом [16]. Генетический анализ клонов плюсовых деревьев выполнен по 5 микросателлитным локусам: SPAG7.14 [13], Psy117 и Psy157 [14], PtTX2146 и PtTX3107 [15] (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика использованных в исследовании праймеров и результаты ПЦР

Характеристика праймеров		Результаты ПЦР
Локус	Последовательность праймеров	Число аллелей	Длина аллелей, п.н.
SPAG7.14	F: TTCGTAGGACTAAAAATGTGTG R: CAAAGTGGATTTTGACCG	8	180–250
Psy117	F: TGGTCTGCAAATCAATCGAA R: GGGTAGGAATGCAAGTTAGGC	5	221–251
Psy157	F: CCCCACATCTCTACAGTCCAA R: TGCTCTTGGATTTGTTGCTG	4	155–205
PtTX2146	F: CCTGGGGATTTGGATTGGGTATTTG R: ATATTTTCCTTGCCCCTTCCAGACA	9	178–243
PtTX3107	F: AAACAAGCCCACATCGTCAATC R: TCCCCTGGATCTGAGGA	7	146–161

Для амплификации микросателлитных локусов использовали следующий режим: предварительная денатурация при 94 °С в течение 15 мин; 35 циклов – денатурация при 94 °С в течение 30 с, отжиг праймеров при 56 °С для локусов Psy117 и PtTX2146, при 58 °С для локуса PtTX3107 и 60 °С для локусов SPAG7.14 и Psy157 в течение 30 с, элонгация при 72 °С в течение 30 с; окончательная элонгация при 72 °С в течение 10 мин и охлаждение до 4 °С в течение 10 мин. ПЦР проводили в приборе СFX96 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, США) с использованием коммерческого набора Encyclo Plus PCR kit (ЗАО «Евроген», Россия). Использован следующий состав реакционной смеси для амплификации микросателлитных локусов общим объемом 15 мкл: буфер – 1,5 мкл, dNTPs – 0,3 мкл, Tag-полимераза – 0,3 мкл, прямой и обратный праймеры – по 0,5 мкл, стерильная вода – 10,9 мкл и матричная ДНК – 1 мкл.

Визуализация продуктов амплификации проведена в буфере ТВЕ путем вертикального электрофореза в 6,0 %-м полиакриламидном геле. Фиксация результатов электрофореза и определение длин аллелей микросателлитных локусов выполнены с использованием системы гель-документирования GelDoc 2000 (Bio-Rad, США) и программного пакета Quantity One® Version 4.6.3. Расчет показателей генетического разнообразия и показателей F-статистики Райта сделаны в программе GenAlEX6 [17].

Результаты и обсуждение

Из 71 клона плюсовых деревьев у 5-ти локусов обнаружено всего 32 аллеля (см. табл. 1). Наибольшее аллельное разнообразие наблюдается в локусах SPAG7.14 (8 шт.) и PtTX2146 (9 шт.). Наименьшее число аллелей установлено для локуса Psy157 (4 шт.). Для сравнения: при тестировании праймеров на 150 деревьях из 5-ти насаждений в Красноярском крае число выявленных аллелей составило: 13 – для локуса SPAG7.14, 9 – для локуса Psy117, 6 – для локуса Psy157, 11 – для локуса PtTX2146 и 8 – для локуса PtTX3107 [18]. В целом количество аллелей у одних и тех же локусов может варьировать в зависимости от размера выборки и района исследования. Например, в Республике Карелии на лесосеменной плантации и в разных насаждениях сосны обыкновенной у локуса PtTX2146 обнаружено от 5 до 10 аллелей [5, 19], у 150 деревьев из Красноярского края – 11 [18], у 28 клонов в Швеции – 15 [20], а у 60 деревьев из двух насаждений Республики Марий Эл – 12 аллелей [21].

Для оценки достоверности различий между рядами распределения частот встречаемости аллелей выполнен χ2-тест (табл. 2). Установлены статистически значимые различия частот встречаемости аллелей у плюсовых деревьев, отобранных на песчаных почвах (А2 и А3), и группы деревьев, произрастающих на суглинистых почвах (С2 и С3), для локусов SPAG7.14 (χ2расч. = 24,90

Таблица 2. Результаты сравнения распределений частот аллелей в группах плюсовых деревьев из разных типов лесорастительных условий с использованием критерия χ ²

Локус Значение χ2табл. при Р=0,01 Значения χ2расч. для сравниваемых групп деревьев в ТЛУ А2 и А3 А2, С2 и С3 А3, С2 и С3 SPAG7.14 18,48 10,09 24,90 32,58 Psy117 13,28 7,13 10,55 4,21 Psy157 11,30 13,91 14,15 85,09 PtTX2146 20,09 17,11 18,78 17,52 PtTX3107 15,09 16,10 62,02 27,97 и 32,58, χ2табл. = 18,48), Psy157 (χ2расч. = 14,15 и 85,09, χ2табл. = 11,30) и PtTX3107 (χ2расч. = 62,02 и 27,97, χ2табл. =15,09). Также установлено, что группы деревьев из ТЛУ А2 и А3 имеют существенные различия в частотах встречаемости аллелей у локусов Psy157 (χ2расч. = 13,91, χ2табл. = 11,30) и PtTX3107 (χ2расч. = 16,10, χ2табл. =15,09). Однако различия статистически значимы не для всех сравниваемых рядов распределения частот встречаемости аллелей. Так, для локусов Psy117 и PtTX2146 не установлено статистически значимых различий в частотах встречаемости аллелей у групп деревьев из разных типов лесорастительных условий, так как во всех случаях расчетный критерий χ2 оказался меньше табличного значения. Кроме того, достоверно не различались частоты аллелей у деревьев из ТЛУ А2 и А3 у локуса SPAG7.14 (χ2расч. = 10,09, χ2табл. = 18,48). Выявленные различия в частотах встречаемости отобранных плюсовых деревьев могут указывать на существование отличий в генетической структуре ценопопуляций, формируемых в разных почвенно-экологических условиях. Такие различия могут быть обусловлены разнонаправленным действием отбора в отличающихся почвенно-эдафических условиях. В то же время различия в частотах встречаемости в нашем исследовании могут быть обусловлены дрейфом генов, т.е. изменением частот аллелей под воздействием существенного сокращения выборки плюсовых деревьев. На наш взгляд, этот вопрос требует дальнейших исследований.

Расчет генетической дистанции Нея показал, что наиболее дифференцированными являются группы плюсовых деревьев, произрастающих на влажных песках (А3) и суглинистых почвах (С2 и С3), у которых генетическая дистанция составила 0,137. Наименее генетически дифференцированными оказались выборки плюсовых деревьев из ТЛУ А2 и А3 (DN = 0,37).

Сравнительный анализ значений показателей генетического разнообразия выявил некоторые различия для групп деревьев из разных типов лесорастительных условий (табл. 3). Так, наивысшие значения наблюдаемой гетерозиготности были у локуса PtTX2146 для плюсовых деревьев, произрастающих на песчаных почвах (0,75 для А2 и 0,88 для А3), в то время как для деревьев на суглинистых почвах наблюдаемая гетерозиготность данного локуса составила 0,43. Различия по уровню наблюдаемой гетерозиготности также установлены для локуса SPAG7.14, значения которого варьировали в разных группах плюсовых деревьев от 0,27 до 0,57. В то же время для локуса Psy117 у всех сравниваемых групп деревьев установлены самые низкие значения наблюдаемой гетерозиготности (0,13–0,15). В целом, по разным литературным данным, наблюдаемая гетерозиготность отдельных микросателитных локусов сосны обыкновенной может варьировать от 0,152 до 0,857 [20–22]. Нужно отметить, что для локусов Psy117 и PtTX3107 у изученных групп плюсовых деревьев определены более низкие значения наблюдаемой гетерозиготности по сравнению с ранее установленными значениями для болотной и суходольной ценопопуляций в том же регионе исследования (0,13–0,15 против 0,50–0,63

Таблица 3. Показатели генетического разнообразия клонов плюсовых деревьев, отобранных в разных типах лесорастительных условий

Локус	Число аллелей на	Эффективное	Гетерозиготность		Индекс фиксации
	локус, N a	число аллелей, Ne	наблюдаемая, Hо	ожидаемая, He	Райта, F

ТЛУ А2

SPAG7.14	7	4,61	0,42	0,78	0,47
Psy117	5	2,30	0,13	0,57	0,78
Psy157	3	2,23	0,25	0,55	0,55
PtTX2146	9	3,77	0,75	0,73	-0,02
PtTX3107	5	3,48	0,25	0,71	0,65

ТЛУ А3

SPAG7.14	8	4,08	0,27	0,77	0,64
Psy117	5	2,87	0,15	0,65	0,77
Psy157	4	1,78	0,15	0,44	0,65
PtTX2146	8	4,54	0,88	0,78	-0,13
PtTX3107	6	3,29	0,33	0,69	0,52

ТЛУ С2 и С3

SPAG7.14 8 4,67 0,57 0,79 0,27 Psy117 5 2,65 0,14 0,62 0,77 Psy157 3 2,29 0,21 0,56 0,62 PtTX2146 6 3,29 0,43 0,69 0,39 PtTX3107 7 5,16 0,50 0,81 0,38 для локуса Psy117; 0,25–0,50 против 0,57–0,67 для локуса PtTX3107) [21].

У большинства изученных локусов всех групп деревьев наблюдается существенный дефицит гетерозигот, о чем свидетельствуют положительные значения индекса фиксации Райта. Наибольший дефицит гетерозигот наблюдается у локусов Psy117 и Psy157, у которых индекс фиксации Райта достигает для разных групп плюсовых деревьев 0,55–0,78. Только у локуса PtTX2146 для плюсовых деревьев, отобранных на песчаных почвах (ТЛУ А2 и А3), установлен незначительный избыток гетерозигот (F = -0,02 и -0,13). Ранее в Республике Марий Эл при изучении болотных и суходольных ценопопуляций сосны обыкновенной также был выявлен небольшой избыток гетерозигот у локуса PtTX2146 (F = -0,04 и -0,01) и дефицит у локусов PtTX2146 и Psy117 (F = 0,09–0,33) [21].

Сравнение показателей генетического разнообразия, рассчитанных для всех микросателлитных локусов, показало, что группы плюсовых деревьев из разных типов лесорастительных условий характеризовались близким уровнем полиморфизма SSR-маркеров. Число аллелей на локус варьировало от 5,80 до 6,20 в сравниваемых группах плюсовых деревьев, эффективное число аллелей – от 3,31 до 3,46, наблюдаемая гетерозиготность – от 0,35 до 0,37, ожидаемая гетерозиготность – от 0,66 до 0,69, индекс фиксации Райта – от 0,48 до 0,49 (табл. 4). В целом для 71 клона плюсовых деревьев сосны обыкновенной, включенных в анализ микроса-теллитных локусов, установлены следующие значения показателей генетического разнообразия: число аллелей на локус – 6,20, эффективное число аллелей – 3,46, наблюдаемая гетерозиготность – 0,35, ожидаемая гетерозиготность – 0,68, индекс фиксации Райта – 0,51. Необходимо отметить, что исследованные плюсовые деревья характеризуются более низким уровнем наблюдаемой гетерозиготности (Н0 = 0,35) по сравнению

Таблица 4. Показатели генетического разнообразия клонов плюсовых деревьев для всех микросателлитных локусов

ТЛУ Число аллелей на локус, N a Эффективное число аллелей, Ne Гетерозиготность Индекс фиксации Райта, F наблюдаемая, Hо ожидаемая, He А3 6,20±0,89 3,31±0,48 0,36±0,14 0,66±0,06 0,49±0,16 А2 5,80±1,02 3,28±0,45 0,36±0,11 0,67±0,05 0,48±0,14 С2 и С3 5,80±0,86 3,61±0,56 0,37±0,08 0,69±0,05 0,49±0,09 Для всех ТЛУ 6,20±0,93 3,46±0,47 0,35±0,11 0,68±0,05 0,51±0,13 с изученными в том же регионе насаждениями сосны обыкновенной с использованием другого набора 5-ти микросателлитных локусов [21]. В целом среднее значение наблюдаемой гетерозиготности при анализе различных комбинаций ядерных микросателлитов для отдельных насаждений и лесосеменных плантаций может варьировать от 0,280 до 0,675 [5, 18, 19, 21].

Анализ структуры генетического разнообразия плюсовых деревьев сосны обыкновенной из разных типов лесорастительных условий с помощью статистики Райта выявил дефицит гетерозигот для всех локусов как на популяционном (FIS = 0,069–0,772), так и на видовом уровне (FIT = 0,083–0,774) (табл. 5). В среднем каждое плюсовое дерево в выборке имеет 48,2 %-й дефицит гетерозигот относительно популяции (FIS = 0,482) и 49,6 %-й дефицит гетерозигот относительно вида (FIT = 0,496). Всего 2,8 % изменчивости приходится на межпопуляционную (в нашем исследовании межгрупповую) компоненту

(FST = 0,028). Наибольшая доля генетического разнообразия сосредоточена внутри сравниваемых групп плюсовых деревьев из разных типов лесорастительных условий (97,2 %). Наибольший вклад в дифференциацию групп плюсовых деревьев из разных типов лесорастительных условий внес локус Psy157 (FST = 0,063).

Выводы

На основе анализа 5-ти ядерных микроса-теллитных локусов (SSR-маркеров) получены качественно новые данные об уровне генетической дифференциации и разнообразия плюсовых деревьев сосны обыкновенной, отобранных в разных типах лесорастительных условий на территории Республики Марий Эл. У 5-ти микро-сателлитных локусов выявлено всего 32 аллеля. В сравниваемых группах плюсовых деревьев обнаружены статистически достоверные различия

Таблица 5. Показатели F-статистики Райта для групп плюсовых деревьев сосны обыкновенной из разных типов условий местопроизрастания

Локус Индекс фиксации особи относительно популяции, FIS особи относительно вида, FIT популяции относительно вида, FST SPAG7.14 0,457 0,467 0,018 Psy117 0,772 0,774 0,008 Psy157 0,603 0,628 0,063 PtTX2146 0,069 0,083 0,015 PtTX3107 0,511 0,529 0,037 Для всех локусов 0,482±0,116 0,496±0,116 0,028±0,010 в частотах встречаемости аллелей у 3-х локусов из 5-ти (SPAG7.14, Psy157 и PtTX3107). Полученные данные свидетельствуют о том, что почвенноэкологические условия могут оказывать влияние на генетическую структуру ценопопуляций, поэтому фактор происхождения плюсовых деревьев необходимо учитывать при реализации программ по селекционному семеноводству сосны обыкновенной на принципах плюсовой селекции. Для решения данного вопроса необходимо провести обследования ценопопуляций, в которых были отобраны плюсовые деревья. По показателям генетического разнообразия изученные выборки плюсовых деревьев из разных почвенных условий не различались. Основная доля выявленного генетического разнообразия находится внутри групп плюсовых деревьев из разных типов лесорастительных условий (97,2 %). В целом данные по изученным плюсовым деревьям по сравнению с литературными сведениями характеризуются сопоставимым аллельным разнообразием, но относительно низким уровнем гетерозиготности.

Работа выполнена при поддержке

Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Грант № 075-15-2021-674) и Центра коллективного пользования «Экология, биотехнологии и процессы получения экологически чистых энергоносителей»

Поволжского государственного технологического университета, Йошкар-Ола