Стероидные сапонины в многолетнем луке Allium schoenoprasum L

Современные научные исследования в области химии природных веществ и фармакологии все больше акцентируют внимание на выделении и характеристике активного действующего начала в растительных экстрактах. Как правило, в растениях биологической активностью обладают сравнительно низкомолекулярные соединения, относящиеся к вторичным метаболитам. Интересным и важным классом вторичных метаболитов являются стероидные гликозиды (СГ), которые относятся к большой группе веществ гликозидной природы, обладающих способностью при растворении в воде образовывать стойкую пену, благодаря чему они и получили название сапонины [1, 2]. Большинство представителей этой группы имеют высокую биологическую активность, которая обусловливает лечебное действие растений. В зависимости от строения агликона стероидные сапонины делятся на две группы – спиростаноловые (СпГ) и фуростаноловые (ФГ), что и приводит к различиям в их физиологическом действии. Стероидные гликозиды представляют большой интерес для фармацевтической промышленности, поскольку их сапогенины используются в качестве исходного сырья для синтеза стероидных гормональных препаратов. Наибольшее значение с этой точки зрения имеют гитогенин и диосгенин, основными источниками которых являются различные виды наперстянки (Digitalis) и диоскорея дельтовидная Dioscorea deltoidea Wall. [2, 3], из корневищ и корней которой был получен целый ряд препаратов, обладающих широким спектром фармакологического действия [3, 4].

Впервые стероидные гликозиды в растениях рода Allium обнаружены в 1943 г., когда из Allium tricoccum выделили сапогенин тигогенин [5]. Это послужило толчком к исследованиям растений рода Allium на содержание СГ, которые позволили выявить большую распространенность сапонинсодержащих видов среди представителей этого рода. На сегодняшний день стероидные сапонины и их генины обнаружены в 45 видах рода Allium. При этом из луков выделено 48 СпГ и 45 ФГ [6–14]. Кроме гликозидов из разных видов лука изолировано 28 генинов, самым распространенным из которых является диосгенин, найденный в 18 видах. С точки зрения поиска сырья, богатого диосгени-ном, представляют интерес A. fuscoviolaceum L. (лук темно-фиолетовый) и A. nutans L. (лук поникающий), содержащие соответственно 2,1 и 2,3 % этого генина [6].

Нами из девяти видов лука-интродуцента из коллекции Ботанического сада Института биологии Коми НЦ УрО РАН (A. angustifolium L., A. komaro-vianum Vved., A. jajlae Vved., A. schoenoprasum L., A. schoenoprasum cv. Prazska Krajova, A. ramosum L., A. nutans, A. giganteum Rgl., A. porrum L., A. narcis-siflorum Wells.) были выделены стероидные гликозиды спиростаноловой и фуростаноловой при- роды, а также генин большинства СпГ диосгенин [15]. Наиболее глубокие исследования содержания стероидных гликозидов проведены для шнитт-лука A. schoenoprasum L. Согласно литературным данным, СГ синтезируются в листьях растений в фу-ростаноловой форме и при транспорте в подземные органы трансформируются в спиростаноловую форму, что показано при изучении биосинтеза стероидных гликозидов в D. deltoidea [3, 16].

Цель работы – изучение содержания и компонентного состава стероидных гликозидов и характера их распределения по органам и частям растения в культивируемых и природных образцах многолетнего лука A. schoenoprasum.

Материалы и методы

Объектом изучения являлись растения шнитт-лука из региональной флоры Республики Коми и культивируемые образцы из коллекции Ботанического сада Института биологии Коми НЦ УрО РАН (БС). Сбор растительного сырья производился с мая по июль 2006 и 2007 гг. в различные фазы развития. Лук-интродуцент выращен в БС из семян, поступивших из Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН (Москва, 1985 г.) и Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений РАСХН (ГУ ВИЛАР). Семена разновидности A. schoenopra-sum var. major получены из Ботанического института РАН (БИН, Санкт-Петербург, 1998 г.), сортовой образец A. schoenoprasum cv. Prazska Krajo-va (лук скорода «Пражска Крайова») – из Барнаула в 1994 г. (табл. 1).

Растения разделяли на части (корневища с корнями, покровные чешуи, луковицы, листья, бутоны, соцветия), измельчали и сушили при комнатной температуре и постоянном вентилировании. Сухое сырье предварительно обезжиривали путем трехкратной экстракции гексаном при комнатной температуре. Выделение суммы СГ проводили трехкратной экстракцией 70%-ным водным этанолом при комнатной температуре и периодическом встряхивании. Водно-этанольные экстракты упаривали в вакууме до полного удаления спирта. Полученные водные растворы выдерживали на холоде в течение суток. Выпавшие осадки СпГ отделяли центрифугированием на центрифуге марки Сentrifuge MPW-210 (Польша) при 12 тыс. об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, остаток высушивали и определяли массу СпГ гравиметрическим методом [17].

Надосадочную жидкость, содержащую ФГ, трехкратно экстрагировали насыщенным водой бутанолом-1. Полученные экстракты объединяли, упаривали в вакууме на роторном испарителе досуха и определяли массу гравиметрическим методом. Сумму ФГ очищали от сопутствующих примесей методом гель-хроматографии на сефадексе G-25 (размер частиц 20-80 мкм), используя в качестве элюента дистиллированную воду.

Компонентный состав суммы стероидных гликозидов (ССГ) определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах «Sorbfil» (Россия, тип сорбента – силикагель ОТХ-1ВЭ, толщина слоя 100 мкм, тип подложки ПЭТФ, размер пластин 10х10 см), “Merсk” (Darmstadt, DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F 254 , толщина слоя 0,25 мм, размер пластин 5х10 и 10х10 см) в системах растворителей хлороформ–этанол–вода (v/v/v): I. 65:35:8; II. 65:23:4; III. 65:12:1,5; IV. 65:1:0,1. Обнаружение компонентов ССГ осуществляли обработкой высушенных пластин ванилин-фосфорной кислотой (ВФК: 1 г ванилина в 100 мл 50%-ной фосфорной кислоты), реактивом Санье (1%-ный раствор ванилина в концентрированной H 2 SO 4 ), который со СпГ дает желтое окрашивание, а с ФГ – зеленое, и специфическим для ФГ реактивом Эрлиха (1%-ный раствор n-диметиламинобензальдегида в 50%-ном этаноле, со-

Таблица 1

Изучаемые образцы лука A. schoenoprasum

Номер образца	Место сбора       1	Координаты (GPS) 1	Дата сбора	1 Фаза развития
1	БС	N 61o37'09'' E 50o45'42''	26.05.2006	Отрастание
2	там же	то же	16.06.2006	Бутонизация
3	там же	то же	16.06.2006	Бутонизация
4*	там же	то же	26.05.2006	Бутонизация
5**	там же	то же	26.05.2006	Бутонизация
6***	там же	то же	26.05.2006	Бутонизация
7	Приполярный Урал, 586 м над ур. м.	N 64o41'11'' E 59o41'04''	8.07.2006	Бутонизация
8	Приполярный Урал, 615 м над ур. м.	N 64o41'04'' E 59o41'28''	10.07.2006	Цветение
		N 62o06'
9	с. Гам, Усть-Вымский р-н	E 49o39'	22.06.2006	Цветение
10	там же	то же	25.06.2006	Цветение
11	БС	N 61o37'09'' E 50o45'42''	13.06.2007	Бутонизация

Примечания: * – форма A. schoenoprasum f. Roseum; ** – разновидность A. schoenoprasum var. Major;

*** – сортовой образец A. schoenoprasum cv. Prazska Krajova.

держащем 5% соляной кислоты), дающим с ФГ ярко-красное окрашивание.

В качестве стандартов для идентификации СГ методами ТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) использовали диосге-нин (Diosgenin(25R)-5-spirosten-3β-ol, чистота 95%, Sigma-Aldrich Chemie Gmbh., Germany), смилагенин (Fluka, USA), ФГ дельтозид и протодиосцин, и СпГ дельтонин, любезно предоставленные д.х.н. В.А.Па-сешниченко (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, г.Москва) и д.б.н. А.М. Носовым (Институт физиологии растений РАН, г. Москва).

Колоночную хроматографию суммы СпГ проводили на адсорбентах силикагель (марка L 100/ 250, Чехия) и нейтральной окиси алюминия (II степень активности по Брокману, Венгрия) в соотношении 1:2 (по массе). В качестве элюента использовали хлороформ с возрастающим градиентом этанола (от 1 до 50%), затем 96%-ный этанол и бутанол.

ВЭЖХ осуществляли в изократическом режиме на хроматографе Smartline (Knauer, Германия). Анализ генинов, СпГ и ФГ проводили на колонке Диасфер 110-С18, 5 мкм, 4х250 мм (БиоХимМак, Россия), петля дозирования 20 мкл, детектор Smartline 2600 на диодной матрице, детекцию осуществляли на длине волны 207 нм. В качестве элюента для генинов использовали метанол, расход подвижной фазы 1 см³/мин. Для ФГ использовали смесь ацетонитрил : вода = 27 : 73 v/v, расход 0,5 см³/мин; для СпГ – смесь ацетонитрил – вода – H 3 PO 4 = 80 : 20 : 0,02 v/v, расход 0,5 см³/мин. Углеводы анализировали на колонке Диасорб-130-Амин, 6 мкм, 4х250 мм, рефрактометрический детектор Smartline RI 2300, петля дозирования 20 мкл, элюент ацетонитрил – вода 80 : 20 v/v, расход подвижной фазы 0,7 см³/мин. Образцы предварительно очищали методом твердофазной экстракции на патронах ДИАПАК С16 (стероидные гликозиды и генины), ДИАПАК Амин (углеводы). Хроматомасс-спектрометрию осуществляли на приборе «Trace DSQ» (Thermo) в режиме полного ионного тока (TIC) при энергии электронов 70 эВ. Условия определения: программирование температуры термостата колонок 110 ⁰С – 6 ⁰С/мин – 350 ⁰С, кварцевая капиллярная колонка 30 м х 0,32 мм (TR - 1, Thermo), толщина пленки – 0,25 мкм. Газ - носитель – гелий, чистота 99,99 %, скорость потока газа-носителя через колонку – 0,6 см³/мин, деление потока – 1:50, температура испарителя 320⁰С, детектора – 200⁰С. Идентификацию соединений осуществляли с помощью библиотек масс-спектров NJST05.

Для проведения гидролиза сумму СГ помещали в стеклянную ампулу, заливали 5 %-ной серной кислотой, ампулу запаивали и выдерживали в сушильном шкафу при температуре 1100С в течение 8 час. После охлаждения до комнатной температуры ампулу осторожно вскрывали и содержимое фильтровали через фильтры Шотта. Маточники трижды экстрагировали диэтиловым эфиром. Эфирные вытяжки объединяли, упаривали досуха и анализировали на содержание генинов с помощью метода ВЭЖХ. Водный остаток нейтрализовали BaCO3 и фильтровали через складчатый фильтр [18]. Содержание углеводов в гидролизатах определяли с помощью метода ВЭЖХ.

Результаты и обсуждение

Многими исследователями было установлено, что в растениях рода Allium СГ накапливаются в подземных органах, цветочных корзинах и семенах. Листья и цветоносные побеги в большинстве своем содержат лишь следовые количества гликозидов и сапогенинов [6]. Наибольшее содержание суммы СГ получено из корней, соцветий и бутонов. Полученные нами данные соответствуют этим утверждениям (табл. 2). Максимальное количество суммы СпГ было обнаружено в природных образцах: в корнях обр. 7 с Приполярного Урала, а также в обр. 10 – из окрестностей с. Гам, где ее содержание составило 6,63 и 4,07 % от массы воздушно-сухого сырья соответственно. Относительно высокое содержание сумм-мы в листьях всех образцов, в среднем от 1,42 до 2,49 %, объясняется довольно значительной примесью балластных веществ, к числу которых можно отнести желтые (каротин) и зеленые (хлорофиллы) пигменты.

Анализ ССГ методом ТСХ с использованием хроматографических систем разной полярности (I – IV) и набора различных проявителей показал наличие в разных частях растения от четырех до шести веществ, из которых два можно отнести к СГ фуростанолового типа (табл. 3). В наиболее полярной системе I на пластинах « Sorbfil» в корнях, луковицах и бутонах был обнаружен несвязанный диосгенин (R f = 0,87), спиростаноловый гликозид дельтонин (R f = 0,60) и два гликозида фуростаноло-вой природы – дельтозид и протодиосцин (R f = 0,27 и 0,31 соответственно). По-видимому, при осаждении СпГ из ССГ происходит частичный захват ФГ, которые были обнаружены при помощи реактива Эрлиха. В покровных чешуях и листьях также выявлен агликон смилагенин. В менее полярной системе III на пластинках фирмы «Merсk» получены аналогичные результаты. Во всех частях растения обнаружены несвязанный диосгенин и дельтонин, а также неидентифицированные вещества с R f = 0,60 и 0,53, в покровных чешуях и бутонах – вещество с R f = 0,58. В корнях, соплодиях и семенах культивируемого растения A. schoenoprasum методом ВЭЖХ установлен спиростаноловый гликозид дельтонин, ранее найденный в луковицах растения A. vineale L. [19]. В корнях, луковицах и листьях, кроме того, было обнаружено неидентифи-цированное вещество со временем удерживания t R = 8'36'', названное нами сапонин А, структура которого устанавливается (табл. 4). В листьях и покровных чешуях идентифицирован диосгенин.

Одним из методов, позволяющих определить структуру стероидных гликозидов, является кислотный гидролиз, при котором образуются генин и моносахариды углеводной части молекулы. В эфир-

Таблица 2

Доля суммы экстрактивных веществ, содержащих спиростаноловые (в числителе) и фуростаноловые (в знаменателе) гликозиды, в A. schoenoprasum (% от сухой массы)

Примечание: прочерк – экстракция не проводилась.

Таблица 3

Часть растения	Номер образца
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Корни	3,07	0,88	0,96	0,93	0,93	0,58	6,63	1,60	-	1,07	0,34
	2,07	2,63	0,69	0,86	4,26	4,68	2,42	2,15	-	1,68	–
Луковицы	1,79	0,31	0,57	1,83	1,23	0,55	1,56	0,79	-	4,07	0,80
	0,89	1,06	0,80	3,26	1,74	4,60	2,58	1,49	-	1,65	–
Покровные чешуи	0,55	0,49	0,49	0,63	-	1,60	0,59	0,60	-	0,95	0,31
	0,96	0,60	0,54	0,30	-	1,95	0,74	0,74	-	0,48	–
Листья	2,00	0,37	1,42	2,32	2,00	1,46	2,40	1,95	-	1,29	2,40
	2,06	1,33	2,14	1,85	3,41	2,86	3,24	3,18	-	2,25	–
Бутоны	-	1,53	0,86	0,78	0,30	2,20	-	2,66	-	-	0,64
	-	3,62	3,94	3,47	5,49	–	-	–	-	-	–
Соцветия	-	2,24	-	2,15	2,50	0,74	-	–––	1,19	2,32	-
	-	3,32	-	4,17	7,12	1,10	-	6,23	5,11	5,84	-
Семена	-	0,87	-	0,58	0,33	4,43	-	-	-	-	-
		0,82		1,12	0,42	0,09

Таблица 4

ТСХ – анализ суммы стероидных гликозидов в разных частях лука A. schoenoprasum

Анализируемый	Коэффициенты	подвижности, R f
образец	Система I, Sorbfil	Система III, Merck
Cтандарты: Смилагенин Диосгенин Дельтонин Протодиосцин Дельтозид	0,90 0,87 0,60 0,31 0,27	0,70 0,68 0,28 – –
Корни	0,88 0,81 0,59 0,30 0,26 0,18	0,68 0,60 0,53 0,48 0,41 0,15
Луковицы	0,87 0,85 0,64 0,27 0,18	0,68 0,60 0,53 0,28 –
Покровные чешуи	0,90 0,82 0,60 0,31 0,25 0,18	0,68 0,60 0,58 0,28 – –
Листья	0,89 0,85 0,65 0,44 0,27 0,19	0,68 0,60 0,53 0,28 0,19 –
Бутоны	0,86 0,85 0,63 –	0,68 0,60 0,58 0,28

Результаты ВЭЖХ-анализа суммы спиростаноловых гликозидов различных частей лука A. schoenoprasum

(время удерживания t R , мин'сек'')

Компоненты	Корни	Луковицы	Покровные чешуи	Листья	Семена
НВ	2'74''	2'67''	2'74''	–	–
НВ	3'13''	–	–	3'07''	–
НВ	–	–	5'24''	–	–
Дельтонин	6'48''	–	–	–	6'51''
НВ	–	–	–	–	8'75''
Сапонин А	8'36''	8'36''	–	8'34''	–
НВ	–	–	9'14''	–	–

НВ – неидентифицированное вещество.

ных экстрактах гидролизатов после кислотного гидролиза суммы СпГ методами ТСХ и ВЭЖХ обнаружен диосгенин, что было подтверждено методом газо-жидкостной хроматографии с совмещенным масс-спектрометрическим детектором. Масс-спектр вещества со временем удерживания, совпадающим с диосгенином (EI, 70 эВ) m/z (I rel , %): 414 (M⁺, 3), 355 (3), 342 (7,5), 300 (13,4), 282 (41), 271 (17,2), 253 (7,5), 159 (8,2), 145 (9), 139 (100), 121 (11,6), 115 (19,4), 105 (13,4), 91 (14,2), 79 (13,4), 69 (30,6), 55 (20,9), где пику со значением m/z = 414 соответствует молекулярный ион М⁺ диосгенина. Это подтверждается сравнением полученных показателей с данными базы спектров библиотеки NJST05.

Анализ водного раствора гидролизата с помощью метода ВЭЖХ позволил обнаружить два пика, соответствующие L-рамнозе с tR = 7'47'' и D-глюкозе с tR = 14'58'' в соотношении 2:1, что характерно для СпГ.

Из водных маточников после отделения центрифугированием суммы СпГ экстракцией бутанолом-1 была выделена СЭВ, содержащая ФГ. Количественное содержание СЭВ ФГ, представленное в табл. 2, находится в диапазоне от 0,02 до 7,12 % от воздушно-сухого сырья. Наибольший выход суммы получен из бутонов (3,6–5,49 %) и соцветий (3,32–7,12 %) всех образцов. Довольно высокое содержание СЭВ ФГ установлено в корнях, где их количество колеблется от 0,69 до 4,68 %. Из литературных источников [3] известно, что наличие ФГ характерно для надземных ассимилирующих органов растений – листьев и стеблей. Согласно нашим данным, листья исследуемых образцов не отличались высоким содержанием ФГ, а в семенах их доля была самой незначительной. Возможно, высокие значения для СЭВ ФГ, особенно из бутонов и соцветий, можно объяснить наличием извлекающихся одновременно водно-спиртовыми смесями сахаристых веществ. При упаривании экстрактов наблюдалась карамелизация сухого остатка, что указывает на присутствие в них углеводов.

Очистка СЭВ ФГ от примесей и получение очищенной суммы ФГ проводилась гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Полученные после гель-хроматографии фракции анализировали на содержание ФГ методом ТСХ на пластинах “Sorbfil” с использованием системы I. Обнаружено четыре пятна с R f = 0,11; R f = 0,27; R f = 0,45; R f = 0,70. По хроматографической подвижности вещество с R f = 0,27 соответствует дельтозиду.

Методом ВЭЖХ были обнаружены два гликозида фуростаноловой природы – дельтозид (t R = 13'12'') и протодиосцин (t R = 14'22'').

Дельтозид и выделенный вместе с ним из корневищ и культуры клеток D. deltoidea дельтонин имеют одинаковое строение гликозидного остатка у третьего углеродного атома С3. К С26 в молекуле дельтозида присоединена молекула D-глюкозы. Второй фуростаноловый сапонин – протодиосцин, ранее выделенный из листьев и культуры клеток диоскореи [3], подобно дельтозиду, является производным (25R)-фурост-5-ен-3β,22,26-триола, у которого к гидроксильной группе при С26 присоединена молекула D-глюкозы, а углеводная часть у С3 состоит из молекулы D-глюкозы и двух молекул L-рамнозы [1, 3].

Выводы

Впервые из разных частей шнитт-лука A. schoe-noprasum L. выделена сумма стероидных гликозидов, содержащая вещества спиростаноловой и фуростаноловой природы. Показано, что генином СГ является диосгенин, который обнаружен как в несвязанном состоянии, так и в продуктах гидролиза суммы стероидных гликозидов. Использование различных хроматографических методов (ТСХ, ВЭЖХ, хроматомасс-спектрометрия) и ИК-спектро- скопии позволило идентифицировать СпГ дельто-нин, а также два ранее выделенных из других растений фуростаноловых гликозида – дельтозид и протодиосцин.

Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-П-4-1023.