Стевиозид как антистрессовый регулятор роста и развития растений

Исследование биологической активности вторичных метаболитов растений имеет важное научное и прикладное значение для поиска и создания на их основе новых полифункциональных регуляторов роста, обладающих как рострегулирующей, так и антистрессовой активностью. К таким биологическим соединениям относятся сладкие дитерпе-ноидные гликозиды растения Stevia rebaudiana Bertoni, агликоном которых является стевиол (13-гидрокси-энт-каур-16-ен-19-овая кислота) [1]. Сте-виол относили к предшественникам гибберелловой кислоты благодаря характерному для гиббереллинов цис-сочленению В и С колец тетрациклической углеводородной системы. Однако было установлено, что грибок Gibberelle Fujikuroi не превращает стевиол в гибберелловую кислоту, а метаболизирует его в гиббереллино-подобное соединение [2]. В литературе есть сведения о том, что производные стевиол-гликозидов проявляют гиббереллиноподобную активность [3]. В связи с возрастающим техногенным загрязнением сельскохозяйственных экосистем тяжелыми металлами актуальным становится использование экологически безопасных регуляторов роста и физиологически активных веществ, способных не только уменьшать токсические эффекты тяжелых металлов, но и снижать их поступление в растения. В связи с этим целью данной работы было выявление протекторных свойств гиббереллиноподобного дитерпеноидного гликозида стевиозида на растения озимой пшеницы при действии низких температур и тяжелых металлов.

Объектом исследования служили растения озимой пшеницы сорта Мироновская 808 и яровой пшеницы сорта Омская 33. Исследуемые дитерпеновые гликозиды были синтезированы в ИОФХ им. А.Е. Арбузова (КНЦ РАН, г. Казань). Растения выращивали в лабораторных условиях в кюветах на водопроводной воде при освещении 100 Вт/м ² и 12-

часовом фотопериоде при температуре 23 ⁰ С в течение 9 сут. В опытных вариантах растения росли на растворе стевиозида (10 ^–8 М). Затем 5-суточные растения переносили на растворы тяжелых металлов CdSO 4 и ZnSO 4 в концентрации 10мкМ и 1мМ. Концентрации стевиозида и тяжелых металлов были подобраны в предварительных экспериментах.

Растворимые лектины экстрагировали 0.05н HCl, лектины клеточной стенки – 0.05% раствором тритона-Х-100. Лектиновую активность определяли с помощью реакции гемагглютинации с эритроцитами 1 группы крови [4]. Белок определяли по методу Bradford [5]. Морозоустойчивость тестировали по выходу электролитов [6].

Содержание тяжелых металллов анализировали в корнях и листьях проростков масс-спектрометре с индуктивно-связанной плазмой Elan DRC II (PerkinElmer, США). Опыты проводили в 3-х биологических повторностях. Результаты опытов представлены на рисунках и в таблицах как средние арифметические и их стандартные ошибки.

Мелкоделяночные опыты были проведены в СПХК «Агрофирма «Рассвет» Кукморского района Республики Татарстан. Опрыскивание растений стевиозидом (10 ^-8 М) проводили с помощью ранцевых опрыскивателей. Сроки опрыскивания яровой пшеницы – в начале фазы выхода в трубку и в фазе кущения. При постановке мелкоделяночных опытов каждый вариант закладывали в четырехкратной повторности. Для учета структуры урожая на каждой делянке закладывали по две метровые площадки, с которых собирали снопы и проводили анализ. Биометрические показатели и площадь листьев определяли по [7].

На первом этапе исследований нами было выявлено соединение, обладающее наибольшей антистрессовой активностью у растений озимой пшеницы Мироновская 808. Для этого определяли LT 50 у проростков, выращенных на растворах стевиози-да (10 ^–8 М) и его производных: стевиола (10 ^–8 М), дигидростевиола (10 ^–8 М), стевиолбиозида (10 ^–8 М) и бис(дигидростевиоил)малоната (10 ^–8 M).

Как видно из таблицы 1, все изучаемые соеди- нения повышали морозоустойчивость растений по сравнению с контролем. Эффект производных сте-виозида на морозоустойчивость проростков сравним с АБК (LT50 проростков пшеницы до –7.6 0С) [8], а действие самого стевиозида даже несколько превышало влияние АБК (LT50 до –8 0С).

Выращивание растений озимой пшеницы на растворе стевиозида (10 ^–8 М) вызывало увеличение длины листьев проростков на 14%, а корней – на 18% по сравнению с контролем (табл. 2). Как высокая (1мМ), так и низкая (10мкМ) концентрации CdSO 4 и ZnSO 4 уменьшали длину корней и листьев проростков озимой пшеницы (табл. 2).

Известно, что торможение роста является общим проявлением токсичности тяжелых металлов для растений, что связано в первую очередь с их прямым действием на деление и растяжение клеток [9]. Согласно нашим данным, наибольшее токсическое действие на рост растений пшеницы оказывает кадмий.

Модификация действия тяжелых металлов на культурные растения при применении различных регуляторов роста показана в ряде работ [10]. Пре- добработка стевиозидом растений Мироновской 808 в течение 5 сут снизила ингибирующий эффект обеих концентраций сульфата кадмия и сульфата цинка на рост проростков (табл. 2).

Анализ накопления металлов в проростках через 4 сут выращивания на средах с тяжелыми металлами показал (табл. 3), что и в корни, и в листья тяжелые металлы поступали в заметных количествах уже при концентрации солей 10 мкМ. В корнях содержание тяжелых металлов было значительно выше по сравнению с листьями. Известно, что корни являются первым барьером на пути транспорта металлов из почвы в растение, и именно корень берет на себя основную функцию по их аккумуляции и детоксикации. Способность корней задерживать тяжелые металлы снижает их транспорт в надземные органы растений [9]. Предварительная обработка растений стевиозидом (10 ^-8 М) вызвала увеличение содержания Cd в корнях проростков озимой пшеницы при концентрации этого металла в среде выращивания 1мМ, во всех остальных вариантах стевиозид снизил аккумуляцию тяжелых металлов в корнях и листьях (табл. 3).

Таблица 1. Влияние стевиозида и его производных на показатель LT 50

Вариант	LT 50 , 0С
Н 2 О	–6.2 ± 0.2
Стевиозид (10–8 М)	–8.0 ± 0.2
Стевиол (10–8 М)	–7.4 ± 0.1
Дигидростевиол (10–8 М)	–6.9 ± 0.3
Стевиолбиозид (10–8 М)	–7.3 ± 0.1
Бис(дигидростевиоил)малонат (10–8 М)	–7.5 ± 0.1

Таблица 2. Влияние стевиозида на длину корней и первых настоящих листьев 9-суточных проростков озимой пшеницы Мироновская 808

Вариант	Н 2 О		Стевиозид
	Длина листьев, мм	Длина корней, мм	Длина листьев, мм	Длина корней, мм
Контроль	159 ± 2.0	90 ± 2.3	180 ± 2.1	107 ± 3.3
CdSO 4 (1 мМ)	69 ± 2.5	45 ± 3.8	100 ± 3.5	67 ± 2.7
CdSO 4 (10 мкМ)	129 ± 1.5	64 ± 2.5	134 ± 3.0	71 ± 1.7
ZnSO 4 (1 мМ)	133 ± 2.7	73 ± 1.5	141 ± 2.3	87 ± 2.5
ZnSO 4 (10 мкМ)	157 ± 3.5	76 ± 1.5	172 ± 1.8	98 ± 3.1

Таблица 3 . Содержание тяжелых металлов в корнях и листьях проростков озимой пшеницы Мироновская 808 (% от сухого веса)

вариант	-стевиозид			+стевиозид
	Н О	Ме (1Мм)	Ме (10мкМ)	Н О	Ме (1мМ)	Ме (10мкМ)
Корни
Cd	0,0002 + + 0,00001	0,7050 + + 0,01000	0,1750 + + 0,00400	0,0003 + + 0,00001	0,7450 + + 0,04000	0,1520 + + 0,00500
Zn	0,0025 + + 0,00080	0,8828 + + 0,06000	0,4404 + + 0,00400	0,0150 + + 0,00007	0,3080 + + 0,01000	0,0541 + + 0,07000
Листья
Cd	0,0001 + + 0,00001	0,0090 + + 0,00030	0,0045 + + 0,00004	0,0002 + + 0,00001	0,0010 + + 0,00050	0,0026 + + 0,00040
Zn	0,0050 + + 0,00050	0,0183 + + 0,00400	0,0069 + + 0,00001	0,0045 + + 0,00080	0,0133 + + 0,00030	0,0066 + + 0,00001

Действие регуляторов роста, прежде всего, осуществляется через изменения в синтезе и активности различных белков. В литературе имеются сведения о наличии у молекул растительных лектинов сайтов связывания фитогормонов, отличных от центров связывания углеводов. Так, агглютинин зародыша пшеницы (АЗП) обладает высоким сродством к ауксинам, цитокининам и гибберелловой кислоте [11]. Исследователи полагают, что комплекс «лектин-фитогормон» является не только транспортной формой гормонов, но и может быть вовлечен в регуляцию процессов роста и развития растений [11]. В связи с этим мы определяли активность лектинов у растений, выращенных на среде с добавлением тяжелых металлов и стевиозида (10 ^–8 М) (рис. 1, 2).

Тяжелые металлы снижали активность лектинов клеточной стенки (рис. 1). Эти изменения могут быть следствием как адсорбции тяжелых металлов в клеточных стенках корней [9], так и взаимодействием ионов металлов с сульфгидрильными группами белков, приводящим к ингибированию их активности и/или разрушению структуры [12].

В то же время CdSO 4 и ZnSO 4 вызывали значительное возрастание активности растворимых лектинов (рис. 2), под которыми мы понимаем, прежде всего, агглютинин зародыша пшеницы. В работе [13] было показано увеличение содержания АЗП в корнях проростков пшеницы при воздействии ацетата кадмия, сопровождающееся усилением выхода этого лектина в окружающую среду.

После предварительной обработки растений в течение 5 сут стевиозидом (10 ^–8 М) эффект тяжелых металлов на активность лектинов клеточной стенки был сходен с изменениями ростовых параметров – на фоне стевиозида восприимчивость связанных с клеточной стенкой лектинов к CdSO 4 и ZnSO 4 уменьшалась (рис. 1). Активность растворимых лектинов при совместном действии стевиозида и тяжелых металлов значительно подавлялась (рис. 2). В настоящее время практически отсутствуют сведения о механизмах действия стевиозида, однако в экспериментах с животными показано, что этот гликозид является антагонистом кальция и уменьшает проницаемость кальциевых каналов [14]. Можно предположить, что именно таким образом стевиозид изменяет поглощение и транспорт Cd и Zn в клетках корня.

Таким образом, согласно проведенному нами исследованию стевиозид (10-8М) снижал аккумуляцию кадмия и цинка в проростках, уменьшал эффект тяжелых металлов на рост растений и изменения активности лектинов, что свидетельствует о его протекторном действии на растения озимой пшеницы в условиях стресса, вызываемого тяжелыми металлами. В связи с этим в следующей части нашей работы нами были проведены полевые испытания стевиозида в качестве регулятора роста и развития растений.

Рис. 1. Влияние CdSO4 и ZnSO4 на активность лектинов клеточной стенки в предварительно обработанных стевиозидом (10–8М) (+Стевиозид) и необработанных стевиозидом (–Стевиозид) корнях проростков озимой пшеницы сорта Мироновская 808: 1 – CdSO4 (1мМ), 2 – ZnSO4 (1мМ), 3 – CdSO4 (10мкМ), 4 – ZnSO4 (10мкМ)

Рис. 2. Влияние CdSO 4 и ZnSO 4 на активность растворимых лектинов в _–8 предварительно обработанных стевиозидом (10 М) (+Стевиозид) и необработанных стевиозидом (–Стевиозид) корнях проростков озимой пшеницы сорта Мироновская 808: 1 – CdSO 4 (1мМ), 2– ZnSO 4 (1мМ), 3 – CdSO 4 (10мкМ), 4 – ZnSO 4 (10мкМ)

По результатам мелкоделяночных опытов, опрыскивание растений яровой пшеницы стевиози-дом (10 ^-8 М) в начале фазы выхода в трубку и в фазе кущения повысило урожайность на 4,02 ц/га или 15% (контроль – 26,8 ц/га, опыт – 30,82 ц/га) (табл. 4). Полученная прибавка урожая обусловлена в значительной степени увеличением массы зерен в колосе, а также озерненности колоса. При этом стевиозид практически не влиял на количество продуктивных стеблей и число колосков в колосе.

В процессе вегетации растения варианта, обработанного стевиозидом, отличались более высоким ростом: в фазу выхода в трубку высота опытных растений была выше на 6,82 %, в фазу колошения – на 26,95% по сравнению с контролем (табл. 5). Площадь листьев растений опытного варианта была на 10,2% больше в фазу выхода в трубку и на 12,9% больше в фазу колошения по сравнению с контрольными растениями. Под влиянием стевио- зида особенно значительно увеличился сырой вес растений в фазу колошения: на 38% по сравнению с контролем. При этом сухой вес увеличился на 6,47%, а содержание воды в растениях – на 60%. Содержание белка и фотосинтетических пигментов под влиянием стевиозида не изменилось. По-видимому, увеличение высоты растений и площади листовой поверхности, более эффективное накоп- ление сухой массы способствовало в конечном итоге формированию более крупных зерен и формированию более озерненного колоса.

Таким образом, согласно проведенным полевым испытаниям на растениях яровой пшеницы Омская 33, установлена эффективность применения сте-виозида в качестве регулятора роста.

Таблица 4 . Величина и структура урожая яровой пшеницы Омская 33

Ё cd s m	s о a a )S ° S У о 4 О ^	cd Л cd О m	§ cd" О w cd 4	О 5 w M о о о к о о ы	о о 5 м СО О о	о й м cd со О m	cd" О О О cd со о m	СО cd S	2 "ст о cd S О
контроль	393± ±0,06	81± ±0,04	8,2± ±0,01	15,35± ±0,03	24,98± ±0,05	0,75± ±0,01	271,45± ±0,06	34,93± ±0,06	26,8± ± 0,05
стевиозид (108М)	409± ±0,07	92,45± ±0,05	8,9± ±0,02	16,2± ±0,04	30,15± ±0,06	1,03± ±0,01	306,2± ±0,05	34,06± ±0,05	30,82± ±0,06

Таблица 5 . Биометрические показатели яровой пшеницы Омская 33

	О S 6 g ц 5	cd )S 8 ® м	масса растений, г		S cd л & со Ч о и	& 2-0 Ч и о v § о ю S	Содержание фотосинтетических пигментов, % массы сырых листьев
			сырая	сухая			хл. а	хл. b	хл. а + хл. b	каро-тино-иды
Фаза выхода в трубку
Контроль	5875,20	70,60±	5,73±	1,74±	3,99±	1226±	14,39±	5,34±	19,7±	4,63±
	±0,09	0,04	0,05	0,01	0,05	0,06	0,06	0,01	0,06	0,01
Стевиозид	6275,70	77,80±	6,07±	1,76±	4,31±	1441±	14,67±	5,94±	20,6±	6,71±
	±0,1	0,02	0,03	0,01	0,03	0,07	0,07	0,02	0,04	0,01
Фаза колошения
Контроль	2605,26	96,80±	4,15±	1,70±	2,45±	1071±	15,17±	5,21±	20,28±	4,35±
	±0,1	0,05	0,04	0,02	0,02	0,04	0,05	0,01	0,04	0,02
Стевиозид	3307,46	108,50±	5,73±	1,81±	3,92±	1166±	15,48±	5,25±	20,73±	4,41±
	±0,1	0,04	0,05	0,03	0,03	0,03	0,06	0,01	0,05	0,03

• 1.    Катаев В.Е., Хайбуллин Р.Н., Шарипова Р.Р., Стробы-кина И.Ю . Дитерпеноиды и гликозиды энт-кауранового ряда: выделение, свойства, химическая трансформация // Обзорный журнал по химии. 2011. Т. 1. № 1. С. 99-167.

• 2.    Ruddat M., Heftman E., Lang A . Conversion of steviol to a gibberellin-like compound by Fusarium moniforme // Arch. Biochem. Biophys. 1965. V. 111. P. 187-190.

• 3.    Тимофева О.А., Невмержицкая Ю.Ю., Мифтахова И.Г., Стробыкина А.С., Михайлов А.Л., Стробыкина И.Ю., Миронов В.Ф. Производные дитерпеноида стевиола регулируют рост и повышают морозоустойчивость озимой

  пшеницы // Доклады Академии наук. 2010. Т. 435. № 2. С. 282-285.

• 4.    Тимофеева О.А. Лектины как активные компоненты адаптивных реакций озимой пшеницы к неблагоприятным условиям среды: Автореф. дис. … д-ра биол. наук. Уфа, 2009. 38 с.

• 5.    Bradford M.A . A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

• 6.    Uemura M., Steponkus P.L . Parallel Effects of Freezing and Osmotic Stress on the ATPase Activity and Protein Composition of the Plasma Membrane of Winter Rye Seedlings //

  Plant Physiol. 1989. V. 91. N 3. P. 961-969.

• 7.    Третьяков Н.Н., Карнаухова Т.В., Паничкин А.А. и др . Практикум по физиологии растений. М.: Агропромиз-дат, 1990. 271 с.

• 8.    Хохлова Л.П., Олиневич О.А., Тараканова Н.Ю., Тимофеева О.А., Воловник И.Л., Палих Э., Раудаскоски М. Цитоскелет-зависимые изменения водного статуса и морозоустойчивости разных генотипов озимой пшеницы // Грани сотрудничества. К 10-летию Соглашения о сотрудничестве между Казанским и Гиссенским университетами: Сб. научн. статей и обз. материалов. Казань: Унипресс. 1999. С. 275-298.

• 9.    Титов А.Ф., Таланова В.В., Казнина Н.М., Лайдинен Г.Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам. Петрозаводск: КарНЦ РАН, 2007. 172 с.

• 10.    Башмаков Д.И., Пыненкова Н.А., Сазанова К.А., Лукат-кин А.С . Влияние синтетического регулятора роста ци-

  тодеф и тяжелых металлов на окислительный статус растений огурца // Физиол. раст. 2012. Т. 59. № 1. С. 6773.

• 11.    Bogoeva V.P., Radeva M.A., Atanasova L.Y., Stoitsova L.Y., Boteva R.N . Fluorescence analysis of hormone binding activities of wheat germ agglutinin // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1698. N 2. P. 213-218.

• 12.    Van Assche F., Clijsters H. Effect of metals on enzyme activity in plants // Plant Cell Environ. 1990. V. 13. P. 195-206.

• 13.    Безрукова М.В., Фатхутдинова Р.А., Лубянова А.Р., Мур-забаев А.Р., Федяев В.В., Шакирова Ф.М . Участие лектина в формировании устойчивости пшеницы к токсическому действию кадмия // Физиол/ раст. 2011. Т. 58. № 6. С. 907-914.

• 14.    Melis M.S . Influence of calcium on the blood pressure and renal effects of Stevioside // Braz. J. Med. Biol. Res. 1992. V. 25. N 9. P. 943-949.

STEVIOSIDE AS ANTI-STRESS CONTROL OF GROWTHAND DEVELOPMENT OF PLANTS