Стратегия создания биомедицинских клеточных продуктов на основе репрограммирования генома методом плазмонной лазерной трансфекции

EDN: CIDTIL

Введение. Современная медицина демонстрирует тенденцию к разработке персонифицированных, высокоспецифичных и эффективных терапевтических подходов, среди которых особое место занимают индивидуальные биомедицинские клеточные продукты (иБМКП) на основе генетически перепрограммированных лимфоцитов. Стратегия создания клеточных терапевтических препаратов стала особенно актуальной с клинической реализацией CAR-Т-клеточной иммунотерапии (chimeric antigen receptor T cell immunotherapy), показавшей значительные перспективы в профилактике, диагностике и лечении гемобластозов в резистентных/рециди-вирующих формах [1]. Принцип технологии основан на изоляции Т-лимфоцитов из периферической крови с последующей их генетической модификацией, направленной на экспрессию химерных антигенных рецепторов. Полученный клеточный продукт, реин-фузированный пациенту, обладает способностью к таргетной деструкции опухолевых клеток. Таким образом, данная методология преобразует аутологичные клетки в терапевтическую систему направленного действия, обеспечивая способность лимфоцитов к специфическому распознаванию и элиминации неопластических клеток.

Ключевым этапом при создании иБМКП на основе CAR-T-клеток является генетическая модификация (именуемая также трансфекцией) Т-лимфоцитов, эффективность которой напрямую зависит от поддержания жизнеспособности функционально активных модифицированных клеток. Известные способы внутриклеточной доставки генетических конструкций включают вирусные и невирусные методы с использованием различных химических агентов и/или

физических воздействий. Существующие вирусные векторы, несмотря на их широкое применение, несут потенциальные риски цитотоксичности, иммуногенности и возврата к патогенности исходного вируса [2]. Кроме того, существует вероятность проявления генотоксических эффектов, обусловленных спонтанным инсерционным мутагенезом в участки генома, ассоциированных с онкогенезом [3]. Напротив, невирусные системы представляют значительный интерес для генетической модификации Т-клеток.

Несмотря на бурное развитие в течение последнего десятилетия технологий на основе разнообразных химических агентов [4] и наноматериалов [5], сохраняются существенные ограничения для внедрения их в производственную практику, включая недостаточную эффективность, сниженную жизнеспособность клеток, проблемы масштабируемости и несовместимость с различными типами клеток и доставляемых агентов. Альтернативную стратегию представляют физические методы доставки [6], основанные на модуляции проницаемости клеточных мембран. Однако такие широко распространенные в лабораторной практике подходы, как микроинъекция, электро-и со-нопорация, часто сопряжены с неприемлемым уровнем клеточного стресса, что проявляется в снижении пролиферативного потенциала и функциональной активности модифицированных клеток.

В настоящей работе рассмотрены возможности генетической модификации Т-клеток путем доставки целевых векторов с использованием разработанной нами ранее технологии лазерной трансфекции (здесь и далее – система оптотрансфекции) [7]. Принцип действия системы заключается в направленном лазерном воздействии, сфокусированном на культуральной поверхности с покрытием наночастицами золота (ЗНЧ), непосредственно контактирующими с поверхностью клеток (рисунок, а ). В результате этого индуцируется повышение проницаемости

а

б

в

Принцип действия технологии оптотрансфекции клеток на платформах ЗНЧ-опто_24 с применением сфокусированного ИК-лазерного облучения ( а ). Результаты оптопорации клеток RAW 264.7: ( б ) флуоресцентные и ( в ) фазово-контрастные микрофотографии клеток; желтой и синей пунктирными линиями показана траектория движения лазерного луча;

масштабные линии соответствуют 50 мкм

цитоплазматических мембран для доставляемых векторов, находящихся в растворе питательной среды [8].

Отличительными преимуществами нашей системы, подтвержденными на уровне расширенных лабораторных испытаний на соответствующем общемировым стандартам уровне [9], являются следующие возможности:

тонкой настройки режимов за счет регулировки параметров лазерного облучения и слоев ЗНЧ, вплоть до проведения трансфекции на уровне единичных клеток;

масштабирования и автоматизации технологического процесса полного цикла от изготовления платформ до осуществления самой процедуры оптопора-ции в условиях научно-медицинского центра.

Цель работы состоит в адаптации технологии репрограммирования генома на основе лазерной трансфекции для создания биомедицинских клеточных продуктов. В частности, будут оптимизированы параметры лазерного воздействия и оценены показатели эффективности оптотрансфекции и выживаемости клеток линии мышиных макрофагов RAW 264.7, являющихся одной из общепринятых релевантных моделей человеческих Т-клеток. Данное исследование является неотъемлемым шагом перед переходом к работе на реальных донорских образцах и позволит провести объективную оценку применимости нашей системы оптотрансфекции для создания целевых иБМКП на основе CAR-T-клеток.

Материал и методы. Для проведения серии экспериментов по оптотрансфекции in vitro использованы разработанные нами ранее специализированные платформы, представляющие собой многолуночные культуральные планшеты с покрытием рабочей поверхности (дно лунок) монослоем ЗНЧ. Платформы представляли собой стандартные 24-луночные полистироловые планшеты с покрытием дна лунок слоями ЗНЧ звездообразной геометрии с поверхностной плотностью упаковки в пересчете на металлическое золото 15 мкг/см2 (здесь и далее используется сокращенный код платформы ЗНЧ-опто_24). Изготовление платформ ЗНЧ-опто_24 осуществлялось по нашей методике седиментационного ассемблирования химически синтезированных ЗНЧ на активированных поверхностях культурального пластика [10].

В работе использованы макрофагально-моноцитарные клетки мыши линии RAW 264.7, полученные из Российской коллекции клеточных культур (ФГБУН «Институт цитологии Российской академии наук», Санкт-Петербург). Поддержание и культивирование клеток осуществляли монослойно в культуральных флаконах на полной питательной среде Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Himedia, Индия), содержащей 10%-ю фетальную бычью сыворотку и 100 мкг/ мл смеси антибиотиков (пенициллин – стрептомицин – неомицин), в клеточном инкубаторе Innova (New Brunswick Scientific, Германия) при 37ºС во влажной атмосфере со средним содержанием CO2 на уровне 5%. Замену питательной среды производили каждые 3–5 дней, клетки пассировали при достижении 80-90% конфлюэнтности монослоя путем стандартной процедуры трипсинизации. В экспериментах по оптотрансфекции участвовали клетки на 2–10-м пассажах. Клетки пересаживали в лунки платформ ЗНЧ-опто_24 путем переноса клеточной суспензии с посевной дозой 8^104 шт./мл с последующим культивированием в течение 24 ч. Расчет посевной дозы осуществлялся на автоматическом счетчике клеток TC20 (BioRad, США). Оптотрансфекцию проводили путем однократного лазерного облучения 1064-нанометровым импульсным лазером с узкосфокусиро-ванным (10 мкм в перетяжке) пучком на дне лунки планшета в режиме 2О-сканирования всей рабочей поверхности. Лазерное облучение проводили с использованием установки LSF-20M (HGTech, Китай). После завершения облучения производили замену питательной среды на среду, содержащую доставляемые агенты. В качестве модельного агента для доставки использован молекулярный флуоресцентный краситель пропидиум иодид - ПИ (Sigma, США) с финальной концентрацией раствора 10 мкМ. Эффективность оптотрансфекции оценивали спустя 6 ч после облучения методом прижизненной микроскопической визуализации путем прямого подсчета относительного числа светящихся клеток на платформах ЗНЧ-опто_24. Анализ проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа NIB620FL (Nexcope, Китай). Оценочный мониторинг состояния клеточного монослоя осуществляли методом фазово-контрастной микроскопии. Количественный анализ жизнеспособности произведен с применением общепринятого метаболического резазурин-теста на основе красителя Alamar Blue [11]. Процедура оптотрансфекции проведена путем трех независимых полных воспроизведений описанных шагов на трех идентичных платформах ЗНЧ-опто_24, количество тестовых и контрольных лунок – по 10 шт. в каждом. В качестве контроля выступали монослои интактных клеток, культивированные в лунках стандартных 24-луночных планшетов. Таким образом, суммарное количество образцов составило 120 с плотностью анализируемых популяций – не менее чем 104 шт. на лунку.

Статистическая обработка полученных данных проведена при помощи стандартных пакетов Microsoft Ехсе1 2010. Полученные данные представлены в виде нормированных на общее число клеток в монослое средних значений долей и их ошибок по результатам трех независимых экспериментов ( M ± SD ). Для статического сравнения данных между опытной и контрольной группами использовали параметрический t -критерий Стьюдента. При p ≤0,05 различия между группами считали достоверными.

Результаты. Первая часть исследований заключалась в определении диапазона рабочих режимов и параметров клеточной плотности для проведения оптотрансфекции. Для этого монослои клеток RAW 264.7, выращенные на платформах ЗНЧ-опто_24, подвергались однократному лазерному облучению при градиентных значениях одного из параметров и неизменных значениях прочих. Затем интегрально оценивали эффективность (относительное количество ПИ⁺-клеток) и жизнеспособность клеток (визуальная оценка и резазурин-тест) через 30 мин и 24 ч после облучения соответственно. В результате определен верхний порог интенсивности облучения 3±0,5 мкДж по наличию существенного угнетения жизнеспособности клеток. Нижний порог интенсивности зарегистрирован на уровне 1,2±0,2 мкДж по отсутствию статистически значимого увеличения числа ПИ⁺-клеток после облучения. При этом жизнеспособность клеток на всем диапазоне режимов сохранялась на уровне 85–90% ( n =50; p <0,05). Максимальное количество ПИ + -клеток зафиксировано при лазерном воздействии с энергией импульса 1,4 мкДж. Параллельно был найден нижний порог стартовой конфлюэнтности клеточного монослоя, составляющий 40% от полного заполнения площади дна культуральных лунок. Посев клеток с последующей оптотрансфекцией при меньшей плотности приводил к замедлению пролиферативной активности и существенной гибели клеток после лазерного воздействия.

Последующая часть работы заключалась в проведении оценочной серии экспериментов при фиксированных режимах лазерного воздействия (1,4 мкДж, скважность – 200 нс, частота – 10 кГц, скорость 2О-сканирования - 0,25 м/с). Статистический анализ учета параметров эффективности оптотрансфекции клеток RAW 264.7 спустя 6 ч после облучения, и анализа жизнеспособности через 24 ч после оптотрансфекции, показал значения 78±7,6 и 84±9,3% (n=120; p<0,05) соответственно. Микрофотографии модифицированных клеток, полученные через 2 ч после лазерного облучения, приведены на рисунке, б и в. Спустя 24 ч естественного самовосстановления клеток характерные визуальные изменения морфологии клеточной поверхности, регистрируемые в первые 5 ч после лазерного излучения, нивелируются, при этом состояние монослоев становится идентичным с контрольными образцами. Дальнейшее культивирование модифицированных клеток в течение 21 дней, поддержание в течение повторяющихся циклов крио-/деконсервации в условиях жидкого азота происходит в пределах нормальных физиологических показателей.

Обсуждение. Известной морфофункциональной особенностью клеток RAW 264.7, как и человеческих лимфоцитов, является невозможность культивирования в высокоплотных культурах: по достижению 70-80% конфлюэнтности монослоя они теряют адгезионную способность, открепляются от субстрата и погибают [12]. Для повышения шансов и увеличения временнóго окна на успешное проведение необходимых манипуляций единственным выходом является снижение стартовой конфлюэнтности монослоя клеток как минимум до 30% на начало трансфекции для того, чтобы было достаточно времени (не менее 72 ч) для самовосстановления клеток, переходу к активной пролиферации и началу экспрессии целевого вектора.

Следует отметить, что использование нашей системы позволяет трансфицировать «трудно трансфицируемые клетки», в том числе лимфоцитарные клетки, при минимальной конфлюэнтности монослоя, в то время как коммерческие агенты [13] предназначены только для 70%-й конфлюэнтности. Применение импульсного наносекундного лазера с широким диапазоном настройки параметров облучения позволяет минимизировать риски при трансфекции клеток и существенно повышает эффективность доставки целевых агентов при незначительном влиянии на жизнеспособность клеток за счет высокой частоты следования коротких импульсов. Комбинация адаптивного лазерного источника с минимальным числом шагов манипуляций от культивирования клеток до трансфекции на единой высокосовместимой платформе ЗНЧ-опто_24 на «привычном» для клеток формате культурального пластика позволяет значительно повысить общую производительность системы оптотрансфекции.

Еще одно важное преимущество нашей системы оптотрансфекции - возможность тонкой настройки параметров облучения импульсного лазера под индивидуальные особенности объектов. Напротив, характерное для электропорации неравномерное распределение поля и невозможность тонкой его настройки и, как следствие, неконтролируемое образование пор в цитоплазматической мембране клеток не позволяют стандартизовать технологию и добиться высокой степени модификации [14]. Так, в недавней работе N. Alawar и соавт. [15] были предложены специализированные условия для проведения электропорации, тем не менее достигнутые значения выживаемости Т-клеток и степень модификации не превышали 30 и 20% соответственно.

Заключение. Показаны адаптивные возможности системы оптотрансфекции для контролируемой высокоэффективной лазерной трансфекции клеток линии мышиных макрофагов RAW 264.7, являющихся одной из общепринятых релевантных моделей человеческих Т-клеток. Достигнутые показатели эффективности создают необходимый фундаментальный базис для трансфера разрабатываемой технологии оптотрансфекции и являются отправной точкой для дальнейшей работы по созданию иБМКП на основе ex vivo- генетической модификации Т-клеток. Возможность тонкой регулировки параметров лазерного воздействия обеспечивает повышенную воспроизводимость результатов генетической модификации и открывает перспективы для создания замкнутых автоматизированных систем производства иБМКП.

Предлагаемая система оптотрансфекции может рассматриваться как принципиально новая конкурентная технологическая платформа, которая будет способствовать продвижению CAR-T и смежных с ней вариантов генно-клеточных персонализированных терапевтических подходов как видов высокотехнологичной медицинской помощи, крайне востребованной и приоритетной в Российской Федерации и во всем мире.

Источники финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России «Разработка системы доставки терапевтических нуклеиновых кислот и биомедицинских клеточных продуктов для целей CAR-T терапии онкогематоло-гических заболеваний на основе инновационной технологии лазерной трансфекции» (регистрационный номер 25030703343-1).