Структура и разнообразие микробной солевой корки в сульфатном озере Гуджирганское Баргузинской котловины (Бурятия)

Микробные сообщества обладают удивительной способностью выживать в экстремальных условиях. Соленые озера являются одним из таких примеров и представляют собой одни из самых обширных биомов нашей планеты. В настоящее время в соленых озерах существует значительный интерес к микробным сообществам, колонизирующим солевую корку на поверхности эвапоритовых отложений [Wierzchos et al., 2006]). Известно, что среды, которые когда-то считались безжизненными, теперь содержат организмы, приспособленные к различным физическим и химическим воздействиям [Ротшильд и Манчинелли, 2001].

Соленое озеро Гуджирганское, расположенное в Баргузинской котловине, относится к группе Алгинских озер. Эти озера образуются в результате разгрузки термальных трещинно-жильных вод, относящихся к сульфатному натриевому химическому типу [Плюснин и др., 2019]. Сульфатное озеро Гуджирганское характеризуется нестабильным водным режимом, полным промерзанием в зимний период и значительными колебаниям солености и температуры воды. В течение сухого сезона большая часть озера покрыта солевыми корками и при понижении температуры наблюдается осаждение мирабилита.

Цель данного исследования — установить структуру микробного сообщества в солевой корке озера Гуджирганское.

Объекты и методы исследования

Исследуемое соленое озеро Гуджирганское (54º01'890" с. ш. 110º16'537" в. д., высота 493 м. над уровнем моря) входит в группу Алгинских озер, мелководное и имеет относительно малые площади — 0,3 км2.

На момент отбора проб (август 2019 г.) площадь озера Гуджирганское была покрыта сухой солевой коркой толщиной от 0,5 до 5 см. На ее поверхности наблюдалось выпадение кристаллов тенардита (Na2SO4). В небольших углублениях была обнаружена вода.

Рис. 1. Район расположения группы Алгинских озер и места отбора образцов в озере Гуджирганское

Для исследований были отобраны образцы солевых корок на станциях (Gudzh-1 и Gudzh-2). На станции Gudzh-1 была отобрана плотная сухая корка белого цвета с толщиной до 1 см, на станции Gudzh-2 образец был представлен сухим зеленым микробным матом с толщиной не более 0,5 см.

В воде на месте отбора проб были измерены рН и температура с помощью портативного рН метра рН-200 HM Digital (Южная Корея) с сенсорным термометром. Минерализацию определяли при помощи тест-кондуктометра TDS-4 (Сингапур). Для химического анализа воду отбирали в стерильную пластиковую бутылку. Макрокомпонентный состав воды определяли с помощью гидрохимических методов в ЦКП ГИН СО РАН (г. Улан-Удэ).

Для молекулярно-генетического анализа пробы осадков и микробных образований отбирали в стерильные пластиковые 15 мл пробирки типа Falkon и фиксировали этанолом до конечной концентрации 50% (об./об.). Пробу воды фильтровали через стерильный мембранный фильтр с порами размером 0,22 мкм. Фильтр затем помещали в стерильную пластиковую микропробирку и фиксировали этанолом. Пробы до выделения ДНК находились в холодильнике при + 4° С.

Выделение ДНК из соляных корок проводили с помощью набора DNeasy-PowerSoil Kit (Qiagen, США) по протоколу производителя. Качественную и количественную оценку полученных препаратов ДНК проводили с помощью спектрофотометра Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Регион V3-V4 гена 16S рРНК был амплифицирован с помощью праймеров 343F (5’-CTCCTACG-GRRSGCAGCAG-3’) и 806R (5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’), содержащих адаптерные последовательности (Illumina), линкер и баркод (Fadroshetal., 2014). Амплификацию проводили вусловиях описанных ранее (Brouchkovetal., 2017). Ампликоны смешивали по 200 нг каждый и чистили в 1% агарозном геле с помощью набора MinEluteGelExtraction Kit (Qiagen). Секвенирование проводили в ЦКП “Биоспарк” (г. Москва) на секвенатореMiSeq (Illumina), используя набор Reagent Kit v3 (2х300, Illumina).

Полученные парные последовательности анализировались с помощью UPARSE скриптов при использовании Usearch v11.0 [Edgar, 2013]. Биоинформа-тическая обработка включала перекрывание парных ридов, фильтрацию по качеству и длине, учет одинаковых последовательностей, отбрасывание синглетонов, удаление химер и получение ОТЕ (Операционные Таксономические Единицы) с помощью алгоритма кластеризации UPARSE. Таксономическая принадлежность последовательностей OTU определялась с помощью SINTAX [Edgar, 2016] и референсной базы 16SRDPtrainingsetv16 [Wangetal., 2007]. Альфа разнообразие анализировали Usearch.

Референсные и ОТЕ последовательности выравнивались с помощью Clustal W. Филогенетический анализ проводили с использованием метода максимального правдоподобия (maximum likelihood phylogeny) в MEGA 6 [Tamura et al., 2013] (бутстреп 1000 альтернативных деревьев, модель Tamura-Nei ).

Результаты и обсуждение

Вода озера Гуджирганское в летний период (август 2019 г.) характеризовалась высокими значениями рН 9,2–9,3, значения минерализации воды в период исследований составили от 132 до 136 г/дм3. В период отбора проб значения температуры воды в озере составили + 19,2 – +23,1 °С. Исследуемое озеро характеризуется восстановленными условиями, окислительно-восстановительный потенциал был в пределах -0,76 мВ. Исследование ионно-солевого состава воды озера показало преобладание ионов натрия — 42 578,5–43 856,9 мг/дм3, что свойственно высокоминерализованным водам. В условиях сухого климата натрий — характерный элемент испарительной концентрации и определяет многие геохимические особенности степных районов. Содержание ионов магния составило 231–243 мг/дм3. В анионном составе доминирующим ионом являлся сульфат-ион. В воде озера обнаружено значительное содержание сульфатов (86 127–83 820 мг/дм3), содержание карбонатов не превышает 510 мг/дм3, гидрокарбонатов — 3 051 мг/дм3). Хлориды — постоянный компонент воды, его содержание в озере составило 2 570 мг/дм3. В воде озера Гуджирганское определены фториды, ионы кремния.

Прокариотические сообщества в озере Гуджирганское

Наши анализы показали, что большинство последовательностей генов 16S рРНК были отнесены к домену Bacteria (до 98%) и сгруппированы в 4 449 OTU.

В образце солевой корки Gudzh-1 было показано, что основу микробного сообщества составляют представители следующих филумов: Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Acidobacteria и Deinococci . В образце солевой корки Gudzh-2 доминировали представители Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes Cyanobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobiae, Gemmatimonadetes и Mollicutes. Для архей все последовательности были классифицированы на Euryarchaeota, Asgardaeota (Gudzh-1) и Euryarchaeota и Nanoarchaeaeota (Gudzh-2).

Рис. 2. Диаграмма катионного и анионного состава воды в озере Гуджирганское

Proteobacteria являлись наиболее распространенным бактериальным таксоном в изученных образцах. В нашем наборе данных 81% последовательностей Gudzh-1 были отнесены к представителям этого филума. Представители класса γ-Proteobacteriam доминировали, на их долю приходилось 56% всех обнаруженных последовательностей. Большинство последовательностей были отнесены к уже известному роду Halomonas . Доля α-Proteobacteria составила 24% общего числа всех последовательностей и представлена родами Rhodobaca, Rhodobacu-lum, Actibacterium и др. Представители δ -Proteobacteria составили 0,7% общего числа всех последовательностей и были представлены следующими родами: Desulfonatronovibrio, Bdellovibrio, Desulfomicrobium и др.

В образце Gudzh-2 доля класса γ-Proteobacteria составила 24% общего числа всех последовательностей и состояла из представителей различных родов, относящихся к Halomonas, Marinospirillum, Nitrincola, Wenzhouxiangella, Methylonatrum и др. Класс α-Proteobacteria представлен многочисленными родами Salinarimonas, Rhodobaca, Roseinatronobacter, Marispirillum и др.

ε-Proteobacteria в образце Gudzh-1 представлена хемолитотрофными Sulfuri-curvum и Sulfurimonas. Представители ε-Proteobacteria обнаружены в различных наземных и морских средах, включая глубоководные гидротермальные источники.

Представители филума Bacteroidetes составили от 4 до 26% общего числа всех последовательностей в изученных микробных сообществах. Доминирующими родами были Planktosalinus, Anditalea, Cyclobacterium, Aquiflexum, Mongoliibacter и Cyclobacterium . Следует отметить у Bacteroidetes обнаружена большая доля бактерий, отнесенных к некультивируемым формам.

Рис. 3. Таксономическое разнообразие микробного сообщества в солевых корках озера Гуджирганское

Количество последовательностей, отнесенных к филуму Firmicutes, составило 7 и 9%. Большинство последовательностей были отнесены к классам Bacilli и Clostridia. К классу Bacilli отнесены алкалофильные бактерии родов Salipaludi-bacillus, Alkalibacterium и др. а также сульфатредуцирующий и арсенатредуци-рующий Desulfuribacillus . Представители этого рода солеустойчивы и алкало-фильны. Среди класса Clostridia наиболее распространены умеренные алкало-филы Anoxynatronum.

Около 3–5% последовательностей в микробном сообществе соляных корок отнесены к Actinobacteria. Последовательности актинобактерий были отнесены к Nitriliruptoria Actinobacteria, Acidimicrobia. Более половины актинобактериальных последовательностей принадлежали Nitriliruptoraceae . Представители актинобактерий отнесены к галотолерантным бактериям из соленых сред обитания со специфическими механизмами адаптации к экстремальным средам, особенно соленым и щелочным местообитаниям [Singh et al., 2012]. В филуме Actinobacteria обнаружены последовательности, которые содержат несколько неклассифицированных и ранее некультивируемых форм бактерий.

Представители архей представлены хемоорганотрофными галофильными Haloferacales. Также нами обнаружены последовательности нового филума Nano-archaeota, который широко распространен и в высокотемпературных биотопах.

В изученных солевых корках встречаются и другие филумы, такие как Verrucomicrobia , Chloroflexi и Deinococci. Эти результаты согласуются с исследованиями, где эти бактериальные филумы, по-видимому, доминируют в этих экосистемах [Farías et al., 2014]. Все эти группы, как известно, в изобилии присутствуют в морских экосистемах, а также в экстремальных условиях, таких как микробные маты из гиперсоленых озер.

В образце Gudzh-1 обнаружены последовательности, отнесенные к филуму Deinococci (2%) и которые представлены родом Truepera. Аэробные и хемоорга-нотрофные Deinococci характеризуются высокой устойчивостью к экстремальным факторам окружающей среды — высокой температуре [Theodorakopoulos et al., 2013] и ионизирующему излучению [Asker et al., 2011]. Мы предполагаем, что присутствие бактерий рода Truepera в озере Гуджирганское косвенно свидетельствует о разгрузке трещинно-жильных термальных вод сульфатно-натриевого химического типа.

Заключение

В этом исследовании мы использовали высокопроизводительное секвенирование бактериальных ампликонов гена 16S рРНК для изучения разнообразия. Proteobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes являются основными филумами, представленными в изученных образцах солевых корок. Показано, что микробные сообщества солевых корок озера Гуджирганское состоят из множества высокоа-даптируемых организмов с гетерогенными физиологическими возможностями. На родовом уровне представлены галофильные и умеренно галофильные алкало-фильные бактерии, такие как Halomonas, Rhodobaca, Rhodobaculum и др. Интересным моментом является обнаружение большой доли последовательностей генов 16S рРНК, которые не могут быть классифицированы на уровне родов, что указывает на потенциальных новых представителей микробного мира, присутствующих в этой экстремальной экосистеме.