Структурная модуляция экспрессии проапоптотического гена TP53 антагонистом NR2B/NMDA рецепторов - Ro25-6981 в мозге взрослых крыс Wistar

Современные данные свидетельствуют о том, что L-глутамат является основным медиатором проведения возбуждения в синапсах нервной системы позвоночных, при этом, идентифицированы многочисленные глутаматные рецепторы, которые критичны не только в быстром проведении возбуждения, но и для пластичности синапсов. Активация рецептора глутаматом приводит к открытию канала рецептора для одновалентных а, в случае, N-метил-d-аспартатных рецепторов (NMDAR) – двухвалентных катионов. Имеются данные о вовлеченности NMDAR в процессы, обеспечивающие способность животных к обучению [6, 35]. Кроме того, было продемонстрировано, что NMDAR важны не только для приобретения новых, но и для воспроизведения ранее приобретенных навыков (28). Имеются факты о том, что в основе участия глутамата в процессах обучения и памяти лежит его регуляция нейрогенеза в гиппокампе взрослых животных, в которую вовлечены NMDAR, так как через них нейротрансмиттер реализует свои сигналы, которые модулируют не только пролиферацию клеток - предшественников, но также скорость нейрогенеза в зубча- той извилине гиппокампа [23, 31]. Обнаружено, что стимуляция NMDA-рецепторов ингибирует нейрогенез, тогда как антагонизм с NMDA может иметь обратный эффект [2]. С другой стороны, имеются также многочисленные свидетельства того, что пролиферация, дифференцировка и миграция как нейронных, так и глиальных клеток происходит во взрослом мозгу, в анатомических структурах, связанных с обучением и памятью [21, 25, 34]. За последние годы накоплены данные о потенциале и пластичности стволовых клеток и клеток-предшественников. Известно, что данные клетки могут трансформироваться в не только нейроны, но также астроциты и олигодендроциты [10]. В связи с этим, было предложено, что вновьобразованные нейроны могут интегрироваться в ранее существовавшие нейрональные сети. Их выживание, степень созревания и апоптотическая смерть зависят от общих условий окружающей среды и обмена веществ [9, 17]. Более того, участие новых нейронов в механизмах обучения и памяти определяется их степенью зрелости [7]. Одним из экспериментальных подходов к изучению роли вновьобразованных клеток в интегративной деятельности мозга включает стимуляцию или блокаду различных стадий нейрогенеза. Блокада NMDAR, в частности, способствует миграции нейронов в гиппокампа (2) как у молодых, так и старых особей [22, 23]. Физиологические эффекты NMDA-рецепторов во многом зависят от составляющих их субъединиц NR2, а в гиппокампе субъединицы NR2A/B, которые сами по себе являются примерами макромолекулярных комплексов с NR1 [18]. Субъединица NR2B широко распространена в нервных стволовых клетках человека и животных, и было постулировано, что NMDAR, содержащие эту субъединицу, могут быть существенными для контроля миграции нейронов и процессов памяти [15, 24].

В конце 1980-х годов был идентифицирован новый класс антагонистов NMDAR (phenylethanolamine ifenprodil) [3]. В связи с этим, появилась возможность изучения одного из представителей, а именно, Ro25-698- селективного антагониста рецепторов NR2B / NMDA [11, 30]. У животных субъединица NR2B экспресируется в предшественниках клеток, которые локализованы в разных областях мозга и дифференцируются в гранулированные нейроны в гиппокампе [25]. Было показано, что у крыс Ro25-6981 стимулирует увеличение количества новорожденных клеток, маркированных BrdU 29-34-дневной стадии в гиппокампальной зубчатой извилине. Этот результаты коррелировали с облегчением формирования пространственного навыка в водном лабиринте Морриса (MWM) [15, 16]. Наряду с функциональной ролью различных «старых» клеток в постнатальном онтогенезе, значительный интерес был сосредоточен на способности к обучению животных, а также корреляции со стадией нейрогенеза [29]. Также описано, что у людей с высокой способностью к обучению генерируется и выживает большее количество новорожденных клеток по сравнению с индивидами, обладающими более низкими способностью к обучению [5]. В предыдущих исследованиях также было обнаружено, что Ro25-6981 в дозе, которая, как известно, стимулирует нейрогенез [15], не влияла на обучение при введении непосредственно перед повторным обучением [27]. При этом, Ro25-6981 способствовал формированию пространственного навыка у этих животных с первоначально неполноценной способностью к обучению (26). Более современные данные свидетельствуют о том, что формирование пространственного навыка чувствительно к Ro25-6981, в процессе которого передача сигналов NR2B / NMDA-рецепторов может быть связана с поведенческой пластичностью, связанной с обновлением пространственной информации [4]. NR2B-содержащие NMDA (NR2B / NMDA) рецепторы важны для контроля нейрогенеза и вовлечены в механизмы долговременной пространственной памяти. В контексте поиска новых соединений для восстановления утраченной памяти при амнезиях межструктурные нейроанатомические профили экспрессии генов, регулирующие нейрогенез и нейроапоптоз у взрослых животных, требуют дальнейшего изучения. Нарушения в механизме запуска и протекания нейроапоптоза (программируемой гибели клеток) приводят к самым нежелательным последствиям для организма. Так, избыточная клеточная смерть уничтожает нейроны, приводя мозг в состояние, при котором наступают нарушения сначала в кратковременной, а потом и долговременной памяти. В этой связи, особый интерес представляет ген р53 (TP53), который является центральным компонентом генетической системы, обеспечивающей удаление нейрональных и глиальных клеток через активацию их гибели по типу апоптоза Показано, что многочисленные сигнальные пути отлеживают состояние клетки и, в случае прихода апоптотического сигнала, вызывают активацию гена TP53, продукт которого – белок р53 – способен координировать процесс репарации или индуцировать процесс апоптоза – программируемой гибели клеток [12, 14]. Обнаружено, что утрата TP53 приводит к бесконтрольному накоплению генетических повреждений, приводящих к потере контроля со стороны организма, злокачественному росту клеток и смерти [12]. Ген TP53 является модулятором транскрипции и специфически взаимодействует с ДНК, трансактивируя при этом такие важные гены, как p21WAF1, который является ингибитором цик-линзависимых киназ и Bax, участвующий в апоптозе клеток [19]. Исследований, направленных на изучение прямого влияния Ro25-698 на экспрессию про-апоптотических генов в мозге взрослых грызунов не описано.

Цель данной работы состояла в изучении эффектов блокатора NR2B /NMDA рецепторов Ro25-698 на экспрессию гена TP53 в гиппокампе, префронтальной коре и мозжечке у половозрелых крыс Wistar.

Материалы и методы.

Эксперименты были проведены на крысах-самцах Wistar (n=30, 3-х месячного возраста и массой 250,0±15,0 г.), которые содержались в стандартных условиях при свободном доступе к пище и воде, а также 12-ти часовом световом режиме при соблюдении этических норм работы с экспериментальными животными, сформулированных Советом Европейского сообщества об использовании животных для экспериментальных исследований (Директива 86/609/EEC в пересмотре от 14.11.2005). Препарат Ro25-6981 (α R ,β S )-α-(4-Hydroxyphenyl)-β-methyl-4-(phenylmethyl)-1-piperidinepropanol maleate произведен фирмой Sigma-Aldrich, USA. Экспериментальным животным Ro25-6981 вводили внутрибрюшинно в дозе 5,0 мг/кг согласно протоколу, описанному в работе [15]. Крысы из группы контроля получали идентичный объем физиологического раствора из расчета 1,0 мл/кг. Нативные животные находились в домашних клетках до забора биологического материала. Через 24 ч по окончании поведенческих экспериментов всех крыс дека-питировали, извлекали на холоду (+4ºС) структуры мозга: гиппокамп, префронтальную кору и мозжечок, которые впоследствии использовали для изучения экспрессии гена TP53 методом ПЦР в режиме реального времени по описанному ранее протоколу [13], применяя в качестве референсного гена - ген β-актина для последующего расчёта относительно -ΔΔCt уровня экспрессии изучаемых генов по методу 2 [20]. Уровень экспрессии гена TP53 в экспериментальной и контрольной группы был подсчитан относительно данных их экспрессии у интактных животных. Экспрессия изучаемого гена TP53 у экспериментальных животных представлена в количестве раз от таковой у животных из группы контроля.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по алгоритмам программы «Statis-tica 7,0». При сравнении нескольких независимых выборок применяли однофакторный непараметрический дисперсионный анализ по методу Крускал-ла-Уолиса (Н-критерий) с последующим post-hoc анализом по U-критерию Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение.

В результате проведенных экспериментов было обнаружено дифференцированное влияние препарата Ro25-698, обладающего выраженными свойствами блокатора NR2B субединицы NMDA-рецепторов и одновременно выступающим активатором нейрогенетических процессов, на экспрессию изучаемого гена TP53 в гиппокампе, префронаталь-ной коре и мозжечке у половозрелых крыс. Было документировано, что наиболее выраженное влияние Ro25-698 оказывал на экспрессию гена TP53 в такой структуре мозга как гиппокамп крыс. Обнаружено, что через 24 часа после введения блокатора NR2B субединицы NMDA-рецепторов Ro25-698 наблюдалось увеличение активности гена TP53 более чем в 70 раз. Учитывая, что Ro25-698 является одновременно активатором нейрогенеза, можно предположить, что, через 24 часа после введения препарата происходит одновременная индукция процессов нейрогенеза, в частности и пролиферации клкток, а также апоптоза «старых» нейронов и глиальных клеток, готовых для элиминации. Более того, данные физиологические процессы протекают при несомненном участии NMDA рецепторов, которые непосредственно вовлечены в механизмы нейрогенеза. Наблюдаемая активация гена TP53 также свидетельствует о выраженном синтезе продукта данного гена – белка P53, который является индуктором апоптоза и участвует в передаче апоптотического сигнала об усилении пролиферативных процессах в ланной структуре мозга другим клеткам. Известно, что гиппокамп является одной из активных нейрогенетических зон мозга, где процессы пролиферации и дифференцировки клеток идут все время. Можно предположить, что одновременная активация нейрогенеза и апоптоза в гиппокампе свидетельствует о сопряженном действии данных процессов для сохранения клеточного потенциала мозга в активном состоянии. Второй по чувствительности структурой мозга с выраженным стимулированием активности гена TP53 оказался мозжечок, где наблюдалось одновекторное с гиппокампом усиление экспрессии гена TP53 в 68 раз. Ранее было отмечено, что в период постнатального развития мозга отмечается изменение конструкции NMDAR, в нём снижается число субъединиц NR2B, NR2D, NR3A, растёт число единиц NR2A и NR2C. Эти изменения различаются в разных областях мозга и подтипах нейронов, и происходят под действием разных факторов: так, в гранулярных клетках мозжечка замена NR2B на NR2C предположительно происходит под воздействием нейрегулинов. Недавно нами было показано, что в релевантных структурах мозга крыс-самцов Wistar, обученных пространственному навыку изменяется экспрессия гена NRG1, белковый продукт которого нейрегулин-1 вовлечен в ряд важных физиологических процессов, в частности в регуляцию процессов нейрогенеза [1]. Показано, что физическая нагрузка и изменение эмоционального состояния в процессе принудительного плавания без обучения в водном лабиринте угнетает на 88 -96% активность гена NRG1 в гиппокампе, префронтальной коре и мозжечке. При этом формирование пространственной памяти было ассоциировано с восстановлением экспрессии гена NRG1и образованием специфического межструктурного ансамбля транскрипционной активности гена NRG1. Максимальный уровень экспрессии гена NКG1 обнаружен в коре (на 200%) и мозжечке (460%) у обученных животных с формированной долговременной памяти по сравнению с контролем. Учитывая ранее полученные данные о влиянии Ro25-698 на механизмы долговременной пространственной памяти [26, 27] и вовлеченности мозжечка в данные процессы, можно предположить о тесной связи изучаемого процесса активации про-апоптотического гена TP53 и экспрессии гена NRG1 в условиях изменяющейся среды. Выявлено, что глутаматные NMDA-рецепторы сконцентрированы в лобной коре, гиппокампе, лимбической системе – областях мозга, которые могут быть вовлечены в различные патогенетические процессы. В наших исследованиях обнаружено, что в отличие от увеличении экспрессирующей способности гена TP53 в ответ на введение Ro25-698 в гиппокампе и мозжечке, в префронтальной коре наблюдали незначительное повышение активности данного гена в 6,4 раз от контрольных животных. Можно предположить, что пре-фронтальная кора с значимой плотностью ионотропных NMDA-рецепторов стала одной из первых мишеней, действия блокатора Ro25-698 с, далее сигнал приняли NMDAR гиппокампа и мозжечка в данных экспериментальных условиях.

Таким образом, показано, что фармакологическая манипуляция с селективными антагонистами рецепторов NMDA, включающих субъединицу NR2B (рецепторы NR2B / NMDA), такими как Ro25-698 вызывает мозге у взрослых крыс структурную активацию про - апоптотического гена TP53, что свидетельствует о том, что блокирование NR2B субъелиницы NMDAR функционально связано с инициацией апоптотического сигнала в клетках гиппокампа и мозжечка.