Структурные реакции сердца и печени мышей CD-1 на однократное введение боркаптата натрия

Kanygin VV, Koldysheva EV, Zav’yalov EL, Razumov IA, Solovyova OI, Kichigin AI, Butikova EA, Kapustina VI. Structural reactions of CD-1 mice heart and liver to a single injection of borocaptate sodium. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2023;31(3):812. (3).812

Введение. Важнейшей медикобиологической задачей остается разработка новых подходов к лечению особо агрессивных злокачественных новообразований, к которым относятся опухоли мозга с высокой пролиферативной активностью, выраженным метастатическим потенциалом, коротким периодом ремиссии и низким уровнем выживаемости пациентов. Одним из таких подходов является бор-нейтронозахватная терапия (далее - БНЗТ), которая относится к разряду лучевой терапии злокачественных опухолей [13]. Считается, что эта технология позволяет объединить принцип органа-мишени, используемый в химиотерапии и принцип анатомической локализации традиционной радиотерапии [4]. Принцип БНЗТ основан на реакции захвата изотопом 10B теплового нейтрона и образованием нестабильного изотопа 11B, который распадается на альфа-частицу и ион лития, что обеспечивает повреждение ДНК и гибель опухолевой клетки, в которой селективно накапливается 10B [5]. Для проведения БНЗТ необходим малотоксичный агент, обогащенный 10B. Одним из таких соединений является боркаптат натрия Na2B12H11SH (BSH). Хотя BSH был впервые использован в клинической практике БНЗТ еще в 1975 году, использование его до сих пор актуально как в экспериментальных исследованиях, так и в клинической практике [6-8]. Однако кардио- и гепатотоксичность этого вещества и его роль в структурных перестройках жизненно важных органов, уровень цитотоксичности для опухолевых и неопухолевых клеток изучена до сих пор недостаточно. Есть данные, свидетельствующие о низкой токсичности BSH применяемом в терапевтической дозе 100 мг/кг [9-11], но, как известно, для подавления опухолевого роста лимитирующим фактором нередко является доза препарата, как, например, это происходит с широко применяемыми антрациклиновыми антибиотиками [12]. В экспериментальных исследованиях использовались дозы препарата до 1000 мг/кг, которые показали LD50 исследуемых лабораторных мышей [13]. Однако такая высокая летальность была связана с недостаточной чистотой синтезированного препарата, а дополнительные морфологические исследования не проводились. В связи с этим актуальность приобретает вопрос дозировки и способа доставки применяемого ве- щества, а также понимание путей взаимодействия борсодержащих препаратов с опухолевой клеткой и организмом в целом. Особое значение имеет исследование возможной структурной реорганизации здоровых тканей в ответ на введение этого вещества [14-15].

Цель исследования: изучение структурных реакций миокарда и печени мышей CD-1 после введения боркаптата натрия, обогащенного изотопом ¹⁰В.

Материалы и методы исследования. В эксперименте использованы мыши-самцы линии CD-1 в возрасте 12 недель, массой 38-45 г (n=56), которых содержали в Центре генетических ресурсов лабораторных животных на базе ЦКП «SPF-виварий» Института цитологии и генетики СО РАН в клетках Tecniplast в контролируемых условиях. Животные были разделены на 3 группы. Группа 1 (n=27) получала 0,9% раствор NaCl, который вводили в том же объеме, что и борсодержащее вещество. Группы 2 (n=15) и 3 (n=14) получали боркаптат натрия (BSH) в дозе 100 и 1000 мг/кг, соответственно. Был использован BSH производства Katchem spol. s. r. o. (Чехия) [CAS 12448-24-7], обогащенный изотопом ¹⁰В (>99.5%), который растворяли в 0,9% растворе NaCl с учетом максимально допустимого объема для инъекции. Инъекции проводили однократно, внутрибрюшинно. Все манипуляции проводили с соблюдением принципов гуманного отношения к животным (Директивой Европейского сообщества 86/609/ЕЕС).

Из эксперимента животных выводили декапитацией через 1, 3 и 7 суток после введения BSH. После вскрытия животного визуально оценивали состояние внутренних органов, проводили взвешивание внутренних органов. Сердце помещали в холодовую камеру до полной остановки, извлекали печень. Образцы стенки левого желудочка сердца и фрагменты печени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина (Biovitrum, Россия). Проводку осуществляли в аппарате STP120 (Microm GmbH, Walldorf, Germany). Парафиновые срезы толщиной 2-3 мкм получали на ротационном микротоме НМ325 (Thermo Fisher Scientific, Runcorn, UK). После стандартной процедуры депарафинации окрашивали ге- матоксилином и эозином с постановкой реакции Перльса. Светооптическое и поляризационно-микроскопическое исследование препаратов проводили с использованием универсального микроскопа Leica DM 4000B. Для получения снимков с препаратов применяли цифровую фотокамеру Leica DFC230 и компьютерную программу Leica QWin3 (Leica Microsystem, Cambidge, UK). При статистической обработке результатов определяли средние значения параметров, вычисляли дисперсию и стандартную ошибку среднего. Для сравнения нормально распределенных количественных данных использовали непарный t-критерий Стьюдента. Отличия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и обсуждение. Однократное введение BSH в дозе 100 мг/кг не приводило к гибели животных, тогда как через 3 часа после вве-

Таблица 1

Масса тела, сердца и печени мышей CD-1 при введении BSH в дозах 100 и 1000 мг/кг, (М±т)

Показатель	1 группа (контроль)	2 группа			3 группа
		Время после введения BSH
		1 сутки	3 сутки	7 сутки	1 сутки	3 сутки	7 сутки
Масса тела, г	41,30±0,96	40,7±0,8	39,3±0,5	41,1±0,6	39,2±2,2	38,3±0,9	45,0±0,4
Масса сердца, г	0,17±0,02	0,22±0,0	0,12±0,0 #	0,10±0,0 #	0,20±0,0	0,14±0,0	0,16±0,0
Относительная масса сердца, мг/г	4,19±0,43	5,37±0,4	3,06±0,5	2,43±0,0 * #	5,15±0,4	3,66±0,7	3,55±0,5
Масса печени, г	2,08±0,08	2,04±0,1	1,86±0,0	2,10±0,0	2,13±0,1	2,0±0,1	2,4±0,1
Относительная масса печени, мг/г	50,18±1,24	50,0±1,5	47,3±0,8	51,1±0,8	54,4±1,8	52,2±1,9	53,3±1,7

Примечание: # - p<0,05 по сравнению с показателем той же группы на 1 сутки; * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой

Светооптическое исследование печени выявило, что общее строение органа во всех группах было сохранено. У контрольных животных цитоплазма гепатоцитов равномерно окрашивалась эозином. Ядра содержали преимущественно эухро-матин, гетерохроматин располагался некрупными глыбками в околоядрышковой зоне или по периметру кариолеммы. Центральные и портальные вены и синусоидные капилляры иногда были расширены, полнокровны.

Через 1 сутки после введения BSH во 2-й и 3-й группах отмечались сходные изменения строения печени. Одно и двуядерные гепатоциты существенно варьировали по размеру, их цитоплазма окра- дения BSH в дозе 1000 мг/кг погибло 1 животное (7%). Масса тела животных в течение эксперимента менялась незначительно. Анализ массы сердца показал снижение этого показателя к 3 и 7 суткам: у животных 2-й группы на 45 и 55% (p<0,05), а у животных 3 группы на 30 и 20% по сравнению с показателями в тех же группах на 1 сутки. Относительная масса сердца у животных 2 группы к 7 суткам эксперимента снижалась по сравнению с контролем (на 42%; p<0,05) и показателем той же группы на 1 сутки эксперимента (на 55%; p<0,05). В 3 группе к 7 суткам наблюдалась сходная тенденция, снижение составляло 12% по сравнению с контролем и 31% по сравнению с показателями той же группы на 1 сутки эксперимента. При анализе динамики массы печени достоверные изменения не выявлены (табл. 1).

шивалась преимущественно равномерно. В то же время следует отметить, что у животных 3-й группы отмечался выраженный полиморфизм ядер и дистрофические изменения, проявляющиеся в вакуолизации цитоплазмы гепатоцитов (рис. 1-Б). В обеих группах гемодинамические изменения выражались в более выраженном расширении центральных и портальных вен и синусоидных капилляров по сравнению с 1-й группой (рис. 1-А).

Через 3 суток после введения BSH у животных 2-й группы цитоплазма гепатоцитов окрашивалась в основном равномерно, но одновременно встречались небольшие участки дольки, в которых гепатоциты были более эозинофильными. Такие участ- ки располагались чаще всего перипорталь-но (рис. 1-А). Наблюдались очаги некроза гепатоцитов из 2-3 клеток, инфильтрированные мононуклеарами. У мышей 3-й группы отмечались более выраженные, чем в предыдущий срок, дистрофические изменения гепатоцитов, заключавшиеся в выраженных просветлениях цитоплазмы, ее очаговом лизисе. У мышей этой группы наблюдалось формирование массивных муфтообразных перицентральных моно-нуклеарных инфильтратов (рис. 2-Б). В обеих группах центральные и портальные вены и синусоидные капилляры были расширены, полнокровны; во многих венах наблюдалось эозинофильное пенистое содержимое (плазмостаз, см. рис. 2-А).

Рис. 2. Микрофото гистологического препарата печени мышей CD-1 через 3 суток после введения BSH. Окр.: гематоксилином и эозином. А - доза препарата 100 мг/кг, ув.: х100. Б -доза препарата 1000 мг/кг, ув.: х200

Рис. 1. Микрофото гистологического препарата печени мышей CD-1 через 1 сутки после введения BSH. Окр.: гематоксилином и эозином. А - доза препарата 100 мг/кг, ув.: х200. Б -доза препарата 1000 мг/кг, ув.: х400

Через 7 суток выраженность структурных изменений печени в каждой группе существенно не менялась по сравнению с предыдущим сроком. Однако следует отметить появление моноцеллюлярных некрозов гепатоцитов (рис. 3-А) в печени мышей обеих групп. У мышей 3-й группы сохранялись более выраженные дистро- фические изменения гепатоцитов по сравнению с мышами 2-й группы (рис. 3, Б). В обеих группах манифестировали выраженные нарушения гемодинамики в виде венозного и синусоидного полнокровия.

Миокард животных контрольной группы не претерпевал заметных изменений. Через сутки после введения BSH в кардиомиоцитах животных 2-й и 3-й групп наблюдались умеренные литические изменения, венозное и капиллярное полнокровие, в остальном миокард этих животных не отличался от контрольного. Следует отметить, что в 3-й группе изменения были более выраженными (рис. 4А-Б).

Рис. 3. Микрофото гистологического препарата печени мышей CD-1 через 7 суток после введения BSH. Окр.: гематоксилином и эозином. А - доза препарата 100 мг/кг, ув.: х400. Б -доза препарата 1000 мг/кг, ув.: х200

Рис. 4. Микрофото гистологического препарата сердца мышей CD-1 через 1 сутки после введения BSH. Окр.: гематоксилином и эозином. А - доза препарата 100 мг/кг, ув.: х400. Б -доза препарата 1000 мг/кг, ув.: х400

Через 3 суток после введения BSH литические изменения в кардиомиоцитах усиливались по сравнению с 1 сутками, иногда появлялись околоядерные «опустошения». К этому сроку у исследованных мышей были выявлены контрактурные изменения миофибрилл. Гемодинамические нарушения выражались в неравномерном венозном полнокровии. В некоторых сосудах наблюдалось «пенистое» содержимое фибриноидной природы (рис. 5-А). Сосудистая стенка у животных 3-й группы выглядела более рыхлой и утолщенной (рис. 5-Б). Содержимое крупных сосудов часто разделялось на плазму и форменные элементы. При исследовании образцов миокарда с помощью поляризационной микроскопии выяснилось, что в обеих группах появлялись миофибриллы подверженные контрактурным изменениям. Следует отметить, что все вышеуказанные изменения миокарда были более выраженными у животных 3-й группы по сравнению со 2-й.

Рис. 5. Микрофото гистологического препарата сердца мышей CD-1 через 3 суток после введения BSH. Окр.: гематоксилином и эозином. А - доза препарата 100 мг/кг, ув.: х200. Б -доза препарата 1000 мг/кг, ув.: х400

Рис. 7. Микрофото гистологического препарата сердца мышей CD-1 через 7 суток после введения BSH в дозе 1000 мг/кг. А – световая микрсокопия, Б – поляризационная микроскопия. Окр.: гематоксилином и эозином. Ув. х400

Рис. 6. Микрофото гистологического препарата сердца мышей CD-1 через 7 суток после введения BSH в дозе 100 мг/кг. А – световая микрсокопия, Б – поляризационная микроскопия. Окр.: гематоксилином и эозином. Ув. х400

Через 7 суток после инъекции BSH сохранялись литические и контрактурные изменения кардиомиоцитов, при этом миокард животных, получавших различные дозы вещества в этот срок эксперимента, незначительно различался по степени выраженности повреждений. Вне зависимости от дозы полученного вещества манифестировали гемодинамические нарушения в виде венозного и капиллярного полнокровия, нередко со сладжированием эритроцитов и диапедезными явлениями (рис. 6-7).

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о сходных структурных реакциях миокарда и печени экспериментальных животных на BSH с реакциями на противоопухолевые препараты таких групп как антрациклиновые антибиотики, алкилирующие агенты, ингибиторы топоизомеразы и некоторые другие. Механизмы, лежащие в основе цитотоксического действия этих агентов, продолжают изучаться, несмотря на длительный период исследования [16-20]. Что касается степени токсичности BSH для неопухолевых клеток этот вопрос остается недостаточно изученным, особенно в аспекте воздействия вещества в виде моно