Study of the effect of lomustin on HER2-positive breast cancer in FVB/N her-2 transgenic mice

У больных раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2 очень высока частота метастазов в ЦНС, достигающая 30–55 % [4], тогда как в общей популяции больных с метастатическим РМЖ этот показатель составляет 5–15 % [5]. Возможности эффективной терапии таких метастазов ограничены. Лечение трастузумаб эмтанзином способствовало увеличению общей продолжительности жизни больных HER2-положительным раком молочной железы с метастазами в ЦНС до 26,8 мес по сравнению с 12,9 мес у больных, получавших комбинацию лапатиниба с капецитабином, однако выживаемость без прогрессирования была одинаково невысокой – 5,9 и 5,7 мес соответственно [6]. К числу химиотерапевтических препаратов, применяемых в лечении метастатического поражения головного мозга, относится ломустин. В связи с высоким риском метастазирования HER2-положительного РМЖ в головной мозг целесообразно исследование собственной активности ломустина при HER2-положительной опухоли.

Материал и методы

В работе использованы мыши линии FVB/N, трансгенные по гену рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2), и мыши BALB/c. Мыши FVB/N, несущие онкоген HER2, первоначально были получены из Национального института старения (Анкона, Италия) и поддерживаются в виде разводки в виварии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России. Эти мыши отличаются значительной частотой развития спонтанных опухолей молочных желез у самок, иногда они возникают и у самцов [7, 8].

В течение эксперимента все животные находились в стандартных условиях содержания (12:12 часовой искусственный режим освещения, проточно-вытяжная вентиляция и температура 20– 25 ºС), получали стандартный комбинированный корм (ООО «Лабораторкорм») и питьевую воду ad libitum. Все экспериментальные исследования проводились в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986), под контролем этического комитета ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России.

Для получения экспериментальной терапевтической модели перевиваемого HER2-положительного рака молочной железы опухоль молочной железы, спонтанно возникшая у мыши-самца линии FVB/N, трансгенной по онкогену HER2, была трансплантирована 9 другим здоровым самцам этой же линии. Перевивка осуществлялась внутримышечно путём введения в бедренную мышцу 0,2 мл 20 % взвеси опухолевой ткани в 0,9 % растворе натрия хлорида. У всех 9 мышей перевивка оказалась положительной. К 31 дню после перевивки масса опухолевых узлов в среднем составила 2463 ± 153 мг. При гистологическом исследовании опухоль характеризовалась как инвазивный рак молочной железы (рис. 1). Исследование мРНК реакцией ПЦР в режиме реального времени по методу delta Ct выявило выраженную экспрессию транскрипта HER2. В криоконсервированном виде опухоль сохраняется в опухолевом банке ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России.

Влияние ломустина (Ломустин медак, ГмбХ Германия) на рост данной опухоли, обозначенной как РМЖ HER2+, изучалось как при её экстра- , так и при интракраниальной трансплантации. Экстракраниальная трансплантация РМЖ HER2+ производилась внутримышечно путем инъекции в бедренную мышцу 0,2 мл 20 % взвеси опухоли в 0,9 % растворе натрия хлорида 28 интактным мышам-самцам линии FVB/N, трансгенной по HER2. Из них 14 мышам на 6-й день после перевивки опухоли был введен ломустин в дозе 50 мг/кг внутрь однократно в виде взвеси в 2,5 % растворе крахмала в объёме 0,2 мл на 10 г массы тела мыши, 14 мышей составили контрольную группу и получили 2,5 % раствор крахмала по 0,2 мл на 10 г массы тела.

Действие ломустина на РМЖ HER2+ у мышей FVB/N сравнивалось с его действием на солидную опухоль Эрлиха у мышей BALB/c. Опухоль Эрлиха была трансплантирована внутримышечно 20 мышам-самцам BALB/c путём инъекции в бедренную мышцу 0,2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, содержащих 5×106 опухолевых клеток из асцита от мыши с асцитной формой опухоли Эрлиха. На 6-й день после перевивки опухоли Эрлиха 10 мышам был введен ломустин однократно перорально в дозе 50 мг/кг в 2,5 % растворе крахмала, 10 мышей служили контролем и получили 2,5 % раствор крахмала.

Интракраниальная трансплантация РМЖ HER2+ производилась путём введения в головной мозг 0,025 мл 20 % опухолевой взвеси по методике, являющейся модификацией метода внутримозгового заражения мышей вирусом бешенства [9]. При гистологическом исследовании в головном мозге выявлялся очаг опухолевого роста (рис. 2). Исследование проводилось на 22 мышах-самцах трансгенной по HER2 линии FVB/N. Через 24 ч после перевивки 10 мышам был введён ломустин в дозе 50 мг/кг однократно перорально в 2,5 % растворе крахмала, 12 мышам контрольной группы был введен перорально раствор крахмала.

Рис. 1. Микрофото. Внутримышечно трансплантированный HER2-положительный инвазивный рак молочной железы у мыши FVB/N. Окраска гематоксилином и эозином, ×400

Рис. 2. Микрофото. Головной мозг мыши FVB/N с трансплантированным интракраниально HER2-положительным инвазивным раком молочной железы. Окраска гематоксилином и эозином, ×400

Противоопухолевая активность при опухолях, трансплантированных внутримышечно, оценивалась по торможению роста опухоли (ТРО), по площади под кинетической кривой роста опухоли (S) и индексу роста опухоли (ИРО), представляющему собой отношение S в исследуемой группе к S в контроле, выраженное в процентах) [10].

Торможение роста опухоли (ТРО) определялось в процентах по формуле

TGI = x 100, vc где TРО – торможение роста опухоли (%); VК – средний объём опухоли в контрольной группе, мм3; V – средний объём опухоли в экспериментальной Э группе, мм3.

Индекс роста опухоли (ИРО) определялся в процентах по формуле

TGI = — x 100,

Sc где ИРО – индекс роста опухоли (%), SЭ – площадь под кинетической кривой роста опухоли в экспериментальной группе, а SK – площадь под кинетической кривой роста опухоли в контрольной группе.

У мышей с РМЖ HER2+, трансплантированной интракраниально, терапевтический эффект оценивался по медиане продолжительности жизни (МПЖ) и по увеличению продолжительности жизни (УПЖ):

1ST = MSTt MSTc x 100, MSTC где МПЖК – медиана продолжительности жизни в контрольной группе; МПЖЭ – медиана продолжительности жизни в экспериментальной группе.

При статистической обработке результатов опытов использовали методы вариационной статистики с использованием пакетов статистических программ SPSS Statistics 17.0 и GraphPad Prism 6.0. Достоверность различий оценивали с

Таблица 1

влияние ломустина на рост перевитого внутримышечно HER2-положительного инвазивного рака молочной железы (рМЖ HER2+)

Группа	Объем опухоли мм3 (M±m), ТРО (%), р к контролю Дни после перевивки                            S          ИРО 12            16            20            24            28
I .Контроль (n=14) II. Ломустин 50 мг/кг (n=14)	495 ± 91     1375 ± 198    2251 ± 262    3612 ± 381    6339 ± 455    50286 ± 4456     100 % 19 ± 7       291 ± 80     795 ± 156    1499 ± 250    3055 ± 358 96 %        75 %        67 %        58 %        52 %       16488 ± 2607     33 % p=0,0004     p<0,0001     p<0,0001     p<0,0001     p<0,0001        p<0,001       p<0,001

Таблица 2

Группа	Объем опухоли мм3 (M±m), ТРО (%), р к контролю Дни после перевивки                            S          ИРО 10             12             15             17            20
I .Контроль (n=12) II. Ломустин 50 мг/кг (n=12)	495 ± 91     1375 ± 198    2251 ± 262    3612 ± 381    6339 ± 455   50286 ± 4456     100 % 19 ± 7       291 ± 80     795 ± 156    1499 ± 250    3055 ± 358 96 %        75 %        67 %        58 %        52 %      16488 ± 2607     33 % p=0,0004     p<0,0001     p<0,0001     p<0.0001     p<0.0001        p<0.001       p<0.001

Таблица 3

влияние ломустина на продолжительность жизни мышей FVB/N с перевитой интракраниально HER2+ опухолью молочной железы

Группа	Число мышей/живы к МПЖ        95% ДИ             УПЖ, % 27 дню
I.    Контроль II.    Ломустин 50 мг/кг	12/0               21             14,2–27,8 10/7              30           27,0–33,0                   43% (р=0,0007)                          (р<0,001)

Примечание: МПЖ – медиана продолжительности жизни, УПЖ – увеличение продолжительности жизни; 95 % ДИ – 95% доверительный интервал.

влияние ломустина на рост перевитой внутримышечно опухоли Эрлиха

использованием критерия t Стъюдента, Fisher’s LSD теста для one-way ANOVA, лог-ранк теста Ментеля-Хензеля.

Результаты и обсуждение

Однократное пероральное введение ломустина в дозе 50 мг/кг обусловило значительное торможение роста перевитого внутримышечно HER2-положительного рака молочной железы (РМЖ HER2+). На 12-й день после перевивки (6-й день после введения ломустина) торможение роста опухоли достигло 96 % (p=0,0004) и в дальнейшем оставалось на достаточно высоком уровне (табл. 1), составив 52 % к концу периода наблюдения на 28 день (p<0,0001). Площадь под кинетической кривой роста опухоли у мышей, получивших ломустин, оказалась почти в 3 раза меньше, чем в контроле, соответственно, индекс роста опухоли (ИРО) составил 33 % (табл. 1).

На рост трасплантированной внутримышечно опухоли Эрлиха у мышей BALB/c ломустин не проявил столь выраженного влияния (табл. 2). При введении ломустина в такой же дозе 50 мг/кг торможение роста опухоли Эрлиха было статистически значимым, но не превышало 39 %. Индекс роста опухоли, достигавший 68 %, не свидетельствовал о заметной активности ломустина при опухоли Эрлиха (табл. 2).

У мышей FVB/N с трансплантированным интракраниально РМЖ HER2+ (табл. 3) медиана