Стволовые клетки колоректального рака в первичной опухоли

Колоректальный рак (КРР) занимает третье место в мире среди наиболее часто диагностируемых видов рака и второе место в структуре онкологической смертности [1]. В последние годы достигнуты значительные успехи в лечении КРР, прогресс обусловлен внедрением методов иммунотерапии, основанных на использовании моноклональных антител к иммунным контрольным точкам, а также таргетной терапии [2]. Между тем, несмотря на использование этих методов лечения, у многих пациентов отмечается прогрессирование заболевания и позднее метастазирование. Предполагается, что одной из причин этого является наличие раковых стволовых клеток (РСК), резистентных к лекарственной терапии [3, 4].

Существуют две модели формирования и развития злокачественного новообразования толстой кишки. Первая – стохастическая (традиционная), согласно которой в результате мутаций клетки эпителия трансформируются в злокачественные [5]. Стохастическая модель канцерогенеза КРР в последнее время подвергается все большему сомнению в связи с обнаружением роли РСК в прогрессировании заболевания. Вторая гипотеза колоректального канцерогенеза – это модель раковых стволовых клеток (иерархическая модель), согласно которой только субпопуляция недифференцированных стволовых клеток обладает способностью индукции, поддержания и прогрессирования опухоли [6]. Раковые стволовые клетки обладают признаками стволовости, то есть способностью к самообновлению, имеют неограниченный пролиферативный потенциал и демонстрируют эффект мультипотентности [7]. Благодаря наличию механизмов репарации ДНК раковые стволовые клетки устойчивы к противоопухолевой терапии [4]. Способность РСК преодолевать различные методы лечения связывают с пластичностью. Мо- дель обратимой клеточной пластичности указывает на способность к динамическому переходу между несколькими различными клеточными фазами, включая дифференцированные и стволоподобные раковые клетки, асимметрично и симметрично делящиеся, покоящиеся и пролиферирующие, эпителиальные и мезенхимальные, а также фазы лекарственной устойчивости и чувствительности. Клеточная пластичность часто рассматривается как фактор, способствующий агрессивному поведению РСК, что способствует поддержанию и прогрессированию опухоли. Этот процесс запускается внутренними или наследственными факторами, которые действуют посредством активации различных транскрипционных факторов, ответственных как за генетические, так и за эпигенетические механизмы, и внешними или приобретенными факторами, которые инициируются микроокружением опухоли [8].

В настоящее время доказано, что опухолевые клетки с фенотипом EpCAMhighCD44+ демонстрируют все свойства стволовых клеток КРР [9]. Вместе с тем, в литературе недостаточно сведений о коэкспрессии данными клетками CD133, CD166, CD24 и CD184. Данные белковые молекулы во многом определяют функциональное состояние РСК. Особую ценность эти знания имеют в контексте характеристик аденокарцином толстой кишки разных стадий и разной степени злокачественности. На наш взгляд, значительный интерес представляет сравнение экспрессии EpCAM и CD44 у больных КРР и пациентов с неопухолевыми заболеваниями толстой кишки. Данные сведения интересны в контексте феномена эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), который имеет место при КРР. РСК являются причиной прогрессирования и рецидивов КРР. Детальное изучение фенотипа РСК, их иммунобиологических свойств необходимо для разработки новых методов лечения КРР [10].

Цель исследования – определить содержание РСК, имеющих фенотип EpCAM^highCD44⁺, в первичной опухоли у больных КРР, а также экспрессию на их поверхности CD133, CD166, CD24 и CD184.

Материал и методы

Выполнено одномоментное поперечное исследование фенотипа РСК у 123 больных аденокарциномой толстой кишки III cтадии, находившихся на лечении в ГУЗ «Краевой онкологический диспансер г. Читы» в период с 2020 по 2025 г. Контрольную группу составили 87 больных, оперированных по поводу неопухолевых заболеваний толстой кишки (пластика колостомы, резекция толстой кишки по поводу дивертикулярной болезни и врожденных аномалий развития) в ГАУЗ «Забайкальская краевая клиническая больница» г. Читы. Основная и контрольная группа сопоставимы по полу и возрасту (p>0,05) (табл. 1).

Забор опухолевой ткани в основной группе и ткани толстой кишки у пациентов контрольной группы производили во время оперативного вмешательства. Исследуемые ткани доставляли в лабораторию в течение 1 ч в термоконтейнере при температуре 5–10 0C, промывали в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) (Miltenyi BiotecGmbH, Германия) и механически измельчали на мелкие фрагметы (2–4 мм). Для получения клеток использовали ферментативный метод. Из-

Таблица 1/table 1

Значимость
Показатель/	Основная группа/	Контрольная группа/	различий/
Parameter	Main group (n=123)	Control group (n=87)	Significance in differences

Характеристика больных основной и контрольной групп Characteristics of patients in the main and control groups

Критерии включения/ Inclusion сriteria

Верифицированный колоректальный рак, первичный статус заболевания/ Verified colorectal cancer, primary disease status

Неопухолевые заболевания толстой кишки (коло-стома, неосложненные дивертикулы, долихоколон, травма кишки без перитонита)/ Non-neoplastic diseases of the colon (colostomy, uncomplicated diverticula, dolichocolon, bowel trauma without peritonitis)

Злокачественные новообразования любой локали-
Критерии исключения/ Exclusion criteria	Лучевая терапия или химиотерапия, аутоиммунные и инфекционные заболевания, воспалительные заболевания толстой кишки/ Radiation therapy or chemotherapy, autoimmune and infectious diseases, inflammatory bowel disease	зации, доброкачественные опухоли толстой кишки, аутоиммунные и инфекционные заболевания, хронические воспалительные заболевания толстой кишки (язвенный колит, болезнь Крона), осложненные формы дивертикулов, долихоколон, перитонит/ Malignant neoplasms of any localization, benign tumors of the colon, autoimmune and infectious diseases, chronic inflammatory diseases of the colon (ulcerative colitis, Crohn's disease), complicated forms of diverticula, dolichocolon, peritonitis	–
Пол/Gender
Женский/Female	76 (61,8 %)	54 (62,1 %)	χ²=0,002;
Мужской/Male	47 (38,2 %)	33 (37,9 %)	p=0,970
Возраст, лет/ Age, years, Me(Q1; Q3)	65,0 (57,0; 70,0)	63,0 (52,0; 69,0)	U=4725,5; p=0,145
	Гистологический тип опухоли/Histological type of the tumor,
Аденокарцинома/ Adenocarcinoma	123 (100 %)	–	–
	Стадия заболевания/Disease stage
III	123 (100 %)	–
III А	6 (4,9 %)	–
III B	74 (60,1 %)	–	–
III С	43 (35,0 %)	–
Степень злокачественности/Differentiation grade
G1	14 (11,4 %)	–
G2	94 (76,4 %)	–	–
G3	15 (12,2 %)	–

Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

мельченные образцы гомогенизировали в течение 60 мин при 37 °C в диссоциаторе GentleMACS Dissociator (Miltenyi BiotecGmbH, Германия) с пробирками С типа и с использованием набора реагентов Tumor Dissociation Kit (Miltenyi BiotecGmbH, Германия) согласно инструкции. Полученную суспензию клеток фильтровали через стерильные клеточные фильтры с размером ячеек 70 мкм, центрифугировали при 400 g в течение 7 мин и ресуспендировали в смеси среды DMEM (Gibco, США) и среды HAM’S F12 (Gibco, США), содержащей 50 МЕ/мл пенициллина–стрептомицина и 4 мМ глутамина в соотношении 2:1. Для оценки жизнеспособности клетки окрашивали красителем 7-AAD (Beckman Coulter, США) и затем подсчитывали с помощью оптического фазово-контрастного микроскопа Nikon Eclipse Ci (Германия).

Суспензию клеток опухолевой ткани в объеме 100 мкл окрашивали следующим коктейлем антител Beckman Coulter, США: CD45-Krome Orange (клон J33), CD44-FITC (клон J.173), CD24-PE (клон ALB9); моноклональными антителами BioLegend, Inc., США: CD166-PE/Cyanine7 (клон 3A6), CD184 (CXCR4)-Brilliant Violet 421™ (клон 12G5), CD326 (EpCAM)-Brilliant Violet 650™ (клон QA20A75), CD133-Brilliant Violet 785™ (клон AC133). Инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте, затем образцы промывали дважды стерильным PBS с добавлением 2 % фетальной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich Co., США) (330 g в течение 7 мин), ресуспендировали в 300 мкл PBS с 2 % нейтральным формалином (кат. HT5011, Sigma-Aldrich Co., Миссури, США) и анализировали методом проточной цитометрии с использованием цитофлуориметра CytoFLEX LX (Beckman Coulter, США). Для обработки полученных результатов применяли программу CytExpert software v.2.0 и Kaluza™ v.2.1.1 (Beckman Coulter, США). Из каждого образца анализировали не менее 50 000 событий. Стратегия гейтирования опухолевых клеток показана на рис. 1.

Результаты исследования представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей (Me [Q1; Q3]). С использованием критерия Колмогорова– Смирнова проводили оценку характера распределения значений в вариационном ряду. Для оценки статистической значимости различий показателей группы больных КРР и контрольной группы использовали непараметрический критерий Манна–Уитни (U). Порогом статистически значимых различий считали р<0,05. При оценке статистической значимости различий в зависимости от степени злокачественности опухоли, в связи с небольшой численностью ряда исследуемых групп (менее 50 наблюдений), проверку нормальности распределения количественных признаков осуществляли с помощью критерия Шапиро–Уилка, обладающего наибольшей статистической мощностью в условиях ограниченных выборок. Первона- чальная оценка различий между тремя группами проведена с помощью непараметрического критерия Краскела–Уоллиса. Попарное сравнение групп проводили с помощью U-критерия Манна–Уитни с учетом поправки Бонферрони, согласно которой критическое значение уровня значимости корректируется по формуле αскорр=α/n, где n – количество проведённых сравнений. При сравнении трёх групп скорректированный порог значимости составляет 0,05/3=0,0167. Таким образом, различия между группами считали статистически значимыми только при условии р<0,0167. Для статистической обработки применяли программу IBM SPSS Statistics Version 25.0 (США).

Результаты

Изучен состав пула клеток нелимфоидного происхождения (CD45-) в зависимости от экспрессии на их поверхности молекулы адгезии эпителиальных клеток EpCAM и дифференцировочного антигена CD44 (табл. 2). При этом не обнаружено значимых различий количества эпителиальных клеток с фенотипом CD45-EpCAM+CD44- в опухолевой ткани у пациентов с КРР и в ткани толстой кишки группы контроля (р=0,072). В первичной опухоли у пациентов с КРР 26,17 [19,35; 31,21] % клеток экспрессируют молекулы EpCAM и CD44. В контрольной группе количество нелимфоидных клеток, имеющих данный фенотип, составило лишь 0,01 [0,0; 0,34] % (р<0,001) (табл. 2). Относительное содержание РСК с фенотипом CD45-EpCAMhighCD44+ в опухолевой ткани при КРР составило 17,15 [11,76; 26,44] % от пула клеток нелимфоидного происхождения. В то же время в контрольной группе не обнаружено клеток, высо-коэкспрессирующих молекулу EpCAM (табл. 2). Установлено, что при КРР в опухолевой ткани в 4,7 раза уменьшается количество клеток стромы, имеющих фенотип CD45-EpCAM-CD44- (р<0,001). Одновременно с этим при КРР значительно увеличивается количество клеток CD45-EpCAM-CD44+ – до 16,28 [9,49; 22,80] %, в контроле – 0,29 [0,02; 1,20] % (р<0,001) (табл. 2).

Наши исследования показали, что у пациентов контрольной группы в ткани толстой кишки не обнаружено РСК с фенотипом EpCAMhighCD44+, экспрессирующих СD133 и CD166. У больных КРР в структуре РСК обнаружено 42,83 [37,07; 51,77] % клеток, одновременно экспрессирующих СD133 и CD166, и 57,17 [48,23; 62,93] % клеток, экспрессирующих дифференцировочный антиген CD133 (табл. 3). Таким образом, показано, что CD133 экспрессируется на всех РСК при КРР.

Кроме того, установлено, что все РСК (EpCAM highCD44+) в первичной опухоли экспрессируют CD184 и 95,18 [88,48; 97,98] % из них одновременно экспрессируют CD24 (табл. 4). Таким образом, истинная частота РСК фенотипа CD44+CD24- при КРР составляет 4,82 %.

Рис. 1. Алгоритм пошагового выявления (тактика «гейтирования») опухолевых клеток на основании экспрессии поверхностных антигенов: A – исключение артефактов включало временные ограничения; Б – выделение живой популяции клеток отрицательной по 7-аминоактиномицин D (7-AAD); В – выделение CD45-отрицательной популяции живых клеток для дальнейшего анализа опухолевых клеток; Г – профили экспрессии EpCAM/CD44 в первичных опухолях толстой кишки. Определены популяции клеток: EpCAMhighCD44+ – раковые стволовые клетки; EpCAM+CD44+; EpCAM-CD44+; EpCAM+CD44-; EpCAM-CD44;

Д, Е, Ё, Ж – оценка экспрессии CD133 и CD166 на популяциях клеток, идентифицированных по маркерам EpCAM и CD44. Определены популяции стволовых клеток как EpCAMhighCD44+CD133+CD166+ и EpCAMhighCD44+CD133+CD166-. На остальных опухолевых клетках отсутствовала экспрессия CD133, но была экспрессия CD166; З – оценка экспрессии CD24 и CD184 на популяции стволовых клеток. Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 1. Algorithm for step-by-step detection (gating tactic) of tumor cells based on the expression of surface antigens. A) Artifact exclusion included time restrictions. B) Isolation of a live cell population negative for 7-aminoactinomycin D (7-AAD). C) Isolation of a CD45negative population of live cells for further analysis of tumor cells. D) EpCAM/CD44 expression profiles in primary colon tumors. The following cell populations were identified: EpCAMhighCD44+ – cancer stem cells; EpCAM+CD44+; EpCAM-CD44+; EpCAM+CD44-; EpCAM-CD44-. E, F, G, H) Evaluation of CD133 and CD166 expression on cell populations identified by EpCAM and CD44 markers. Stem cell populations were identified as EpCAMhighCD44+CD133+CD166+ and EpCAMhighCD44+CD133+CD166-. The remaining tumor cells lacked CD133 expression, but did express CD166. I) Evaluation of CD24 and CD184 expression on the stem cell population.

Note: created by the authors

Проведена оценка экспрессии изучаемых белков на поверхности опухолевых клеток в зависимости от степени злокачественности опухоли. У больных с высокодифференцированной аденокарциномой количество клеток EpCAMhighCD44+ в первичной опухоли в 1,5 раза ниже по сравнению с пациентами с умеренно дифференцированной (U=326,5, p=0,002) и в 2,1 раза – по сравнению с низкодифференцированной аденокарциномой (U=21,0, p<0,001). Прочих значимых различий

Таблица 2/table 2

Экспрессия epCaM и Cd44 клетками нелимфоидного происхождения в первичной опухоли у больных колоректальным раком (от Cd45- клеток, %)

expression of epCaM and Cd44 by non-lymphoid cells in the primary colorectal cancer tumor (from Cd45-cells, %)

Фенотип клеток/ Cell phenotype	Группы больных/Patient groups						Тестовая статистика/Test statistics
	Группа контроля/ Control group			Колоректальный рак/ Colorectal cancer (n=123)			Критерий Манна– Уитни/ Criterion Mann–Whitney	p-value
	Q1	(n=87) Me	Q3
				Q1	Me	Q3
CD45-EpCAM+CD44+	0,0	0,01	0,34	19,35	26,17	31,21	0,0	<0,001
CD45-EpCAMhighCD44+	0,0	0,0	0,0	11,76	17,15	26,44	0,0	<0,001
CD45-EpCAM+CD44-	15,86	21,99	28,66	13,60	19,03	27,16	4569,0	0,072
CD45-EpCAM-CD44+	0,02	0,29	1,20	9,82	16,43	21,60	172,0	<0,001
CD45-EpCAM-CD44-	69,13	77,12	81,85	9,49	16,28	22,80	0,0	<0,001

Примечаниe: таблица составлена авторами.

Notes: created by the authors.

Таблица 3/table 3

Экспрессия Cd133 и Cd166 раковыми стволовыми клетками в первичной опухоли у больных колоректальным раком (от epCaM high Cd44+ клеток, %)

expression of Cd133 and Cd166 by cancer stem cells in the primary tumor of colorectal cancer patients (from epCaMhigh Cd44+ cells, %)

Фенотип раковых стволовых клеток/ Phenotype of cancer stem cells	Группы больных/Patient groups					Тестовая статистика/Test statistics
	Группа контроля/ Control group			Колоректальный рак/ Colorectal cancer (n=123)
						Критерий Манна–Уитни/ Criterion Mann–Whitney	p-value
	Q1	(n=87) Me	Q3
				Q1	Me     Q3
EpCAM high CD44+ CD133+CD166+	0,00	0,00	0,00	37,07	42,83     51,77	0,0	<0,001
EpCAM high CD44+	0,00	0,00	0,00	48,23	57,17     62,93	0,0	<0,001
CD133+CD166-

Примечаниe: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

Таблица 4/table 4

Экспрессия дифференцировочных антигенов Cd24 и Cd184 раковыми стволовыми клетками у больных раком толстой кишки (от epCaM high Cd44+ клеток, %)

expression of Cd24 and Cd184 differentiation antigens by cancer stem cells in patients with colon cancer (from epCaMhigh Cd44+ cells, %)

Фенотип раковых стволовых клеток/ Phenotype of cancer stem cells	Группы больных/Patient groups					Тестовая статистика/Test statistics
	Группа контроля/ Control group (n=87)			Колоректальный рак/ Colorectal cancer (n=123)
						Критерий Манна–Уитни/ Criterion Mann–Whitney	p-value
	Q1	Me	Q3	Q1	Me     Q3
EpCAM highCD44+ CD24+CD184+	0,00	0,00	0,00	88,48	95,18     97,98	0,0	<0,001
EpCAM highCD44+ CD24-CD184+	0,00	0,00	0,00	2,02	4,82      11,52	0,0	<0,001

Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

Таблица 5/table 5

Экспрессия epCaM, Cd44, Cd133, Cd166, Cd24 и Cd184 раковыми стволовыми клетками у больных раком толстой кишки в зависимости от степени злокачественности опухоли, Me [Q1; Q3] expression of epCaM, Cd44, Cd133, Cd166, Cd24, and Cd184 by cancer stem cells in patients with colon cancer depending on the tumor grade, Me [Q1; Q3]

Фенотип раковых стволовых клеток/ Phenotype of cancer stem cells	Больные колоректальным раком/ Patients with colorectal cancer			Тестовая статистика/ Test statistics
	G1 (n=14) 1	G2 (n=94) 2	G3 (n=15) 3	Критерий Краскела Уоллиса/Criterion Kruskal–Wallis	–           Критерий Манна–Уитни/ Criterion Mann–Whitney
EpCAMhighCD44+ (от CD45-, %)	11,7 [9,1; 13,7]	17,7 [11,9; 25,9]	24,9 [16,8; 30,2]	H=15,5 p<0,001	U1–2=326,5 p1–2=0,002 U1–3=21,0 p1–3<0,001 U2–3=459,0 p2–3=0,03
CD133+CD166+ (от EpCAMhigh CD44+, %)	39,3 [29,4; 44,6]	43,5 [37,4; 52,1]	42,8 [37,6; 51,9]	H=4,0 p=0,13	U1–2=439,0 p1–2=0,045 U1–3=72,0 p1–3=0,15 U2–3=704,0 p2–3=0,99
CD184+CD24+	97,1 [93,3; 99,0]	94,9 [88,3; 98,3]	95,0 [83,4; 96,4]	H=3,8 p=0,15	U1–2=501,5 p1–2=0,15
(от EpCAMhigh CD44+, %)					U1–3=57,0 p1–3=0,036 U2–3=590,0 p2–3=0,31