Субстраты энергетического обеспечения скелетных мышц при оперативном удлинении костей голени

Сократительная функция скелетных мышц обусловлена возможностью превращения энергии биохимических процессов в механическую работу. Метаболизм в скелетных мышцах специализирован таким образом, чтобы достаточно эффективно обеспечивать синтез АТФ для работы сократительной системы, образуя тем самым единый структурнометаболический комплекс, обеспечивающий функциональную активность органа. Для пополнения запаса АТФ в мышцах используются следующие энергетические источники: 1. Анаэробное расщепление углеводов (гликолиз, гликогенолиз) и креатинфосфата; 2. Аэробное расщепление углеводов; 3. Аэробное расщепление липидов (β-окисление) [2, 3]. Вклад каждого из этих источников в энергети- ческое обеспечение мышц при внешних нагрузках зависит как от доступности субстратов окисления в крови [7, 8], так и от запасов внутритканевых источников энергии [4, 9, 10]. Ранее нами было показано, что при удлинении конечностей одним из ключевых процессов в энергообмене скелетных мышц удлиняемого сегмента конечности становится гликолиз [5]. Однако вопрос о субстратах энергообмена (в том числе и гликолиза), а также роль внутритканевых и внетканевых источников энергетического обеспечения мышц при удлинении остается открытым.

Цель исследования — изучить особенности субстратного обеспечения скелетных мышц в условиях оперативного удлинения костей голени по методу Илизарова.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 36 взрослых беспородных собаках, которым в течение 28 дней осуществляли удлинение костей голени по Илизарову. Режим удлинения составлял 1 мм/сутки за 4 приема. Животных выводили из опыта путем внутривенного введения летальных доз барбитуратов через 14, 28 суток дистракции, 15, 30 суток фиксации и 30, 180 суток после снятия аппарата. На проведение экспериментальных и клинических исследований получено разрешение комитета по этике при ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г. А. Илизарова Минздравсоцразвития РФ».

Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных, «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и требованиями инструкции № 12/313 Министерства здравоохранения РСФСР «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06.01.73 г.

Активность АсАТ, АлАТ, концентрацию лактата в ткани, а также концентрацию глюкозы, общего холестерина, триглицеридов в сыворотке крови определяли на фотометре Stat Fax® 1904 Plus (США), используя наборы реагентов фирмы Vital Diagnostic (РФ). В депротеинизированном саркоплазматическом и сывороточном растворе находили содержание пирувата по методу Umbright в модификации Бабаскина [1]. Уровень гликогена в мышцах определяли непрямым антроновым методом, содержание общих липидов в мышцах находили гравиметрическим методом, после их экстракции хлороформ/метаноловой смесью (2:1) [6]. Общие липиды сыворотки крови определяли с по -мощью наборов реактивов фирмы La Chema (Чехия), общий белок — по Лоури [6].

Достоверность различий между выборками оценивали с помощью W-критерия Вилкоксона для независимых выборок. Корреляционную зависимость оценивали по критерию Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования показали, что в ПББМ и ИКМ удлиняемого и контралатерального сегмента конечности в качестве энергетических источников использовались различные субстраты. Так, значительное снижение запасов гликогена в ходе эксперимента мы отмечали только в ПББМ удлиняемого сегмента (табл. 1). При этом уровень гликогена в ПББМ контралатеральной конечности на этапе дистракции и фиксации превышал его содержание в мышцах здоровых животных более чем вдвое. В ИКМ оперированной и контралатеральной конечности содержание гликогена статистически значимо от нормы на всех сроках наблюдения не отличалось.

Одними из энергетических источников в ИКМ на этапах удлинения и фиксации могли являться внутритканевые запасы липидов, снижение уровня которых в ИКМ удлиняемой и контралатеральной конечности мы наблюдали на этапе фиксации и через месяц после снятия аппарата (табл. 2). Уменьшение запасов липидов в мышцах обеспечивало «сохранность» углеводных энергетических резервов, подтверждение чему — обнаруженная нами на этапе дистракции обратная зависимость между уровнем гликогена и общих липидов в ИКМ как оперированной, так и контралатеральной конечности: r = –0,69 (р = 0,05) и r = –0,67 (р = 0,05) соответственно.

Внемышечные источники липидов, присутствующие в крови, либо вообще не использовались мышцами, либо их использование компенсировалось их потреблением, т. к. достоверных изменений концентрации общих липидов, триглицеридов и общего холестерина на сроках наблюдения не обнаруживалось, хотя для общих липидов и триглицеридов наблюдалась тенденция к снижению концентрации в сыворотке крови с конца этапа дистракции до конца фиксации.

Проведенные результаты показывают, что в удлиняемой ПББМ основным субстратом энергообмена являлся гликоген ткани, здесь активировался про- цесс гликогенолиза, в контралатеральной ПББМ и в ИКМ обеих конечностей — гликолиз. Однако, вопреки ожиданию, роста суммарного содержания продуктов гликолиза в мышцах удлиняемого сегмента конечности в ходе эксперимента не наблюдалось, мало того, происходило снижение их концентрации относительно значений здоровых животных (рис. 1).

Наблюдаемое снижение содержания лактата и пирувата в мышцах на фоне активации в них гликолиза связано с: 1) увеличением реакций пере-аминирования в ткани, способствующих утилизации из мышц пирувата и аминного азота в составе аланина в печень (аланиновый цикл); 2) с активацией цикла Кори, осуществляющего перенос лактата взамен глюкозы между мышцами и печенью. В пользу обоих предположений свидетельствовал рост концентрации глюкозы и лактата в сыворотке крови на фоне снижения содержания в ней пирувата (рис. 2). Дополнительное подтверждение этого — обнаруженная нами обратная зависимость между уровнем лактата в сыворотке крови и его содержанием в мышцах удлиняемого сегмента: для ПББМ r (кровь/ПББМ) = (–0,67) (р = 0,05), для ИКМ r (кровь/ИКМ) = (–0,69) (р = 0,05).

В свою очередь, об активации аланинового цикла говорило обнаруженное нами в мышцах увеличение на 28-е сутки дистракции ферментативной активности трансаминаз, ферментов, катализирующих первую реакцию аланинового цикла — реакцию трансаминирования (табл. 3). При этом если в ПББМ удлиняемого сегмента конечности и в ИКМ обеих конечностей увеличивалась активность как АлАТ, так и АсАТ, то в ПББМ контралатеральной конечности возрастала активность только АсАТ. Представленное наблюдение подтверждает высказанное выше предположение об участии аминотрансфераз в утилизации пирувата, образующегося в ткани в результате активации гликолитических процессов.

Таблица 1

Содержание гликогена (мг/100 мг ткани) в скелетных мышцах собак при оперативном удлинении костей голени (Медиана; 25-й÷75-й процентили)

Этап эксперимента		Дистракция		Фиксация		После снятия аппарата
мышца	Здоровые животные (n = 6)	14-е cутки (n = 5)	28-е сутки (n = 5)	15-е сутки (n = 5)	30-е сутки (n = 5)	1-й месяц (n = 5)	6-й месяц (n = 5)
ОПБ	2,66	0,99 0,01 0,53÷2,70	1,04 0,05 0,32÷2,71	1,33 0,05 0,76÷1,86	0,74 0,05 0,49÷1,77	4,19 3,35÷5,20	4,47 3,51÷4,75
КПБ	2,37÷3,46	5,58 0,01 4,43÷7,19	5,63 0,05 3,62÷6,65	4,41 0,05 4,24÷4,77	5,06 3,35÷6,02	3,92 3,30÷4,52	3,98 2,26÷5,19
ОИМ	3,53	2,78 1,49÷3,88	2,48 1,70÷2,87	2,61 2,17÷3,29	3,57 2,62÷4,57	2,43 1,75÷4,17	2,83 2,05÷3,50
КИМ	2,91÷4,83	3,952,÷267,01	4,11 2,74÷6,90	3,41 2,88÷4,08	3,440,÷252,19	3,45 2,16÷5,10	4,53 2,98÷5,21

Примечание. ОПБ и КПБ — передняя большеберцовая мышца удлиняемого и контралатерального сегмента конечности соответственно; ОИМ и КИМ — икроножная мышца удлиняемого и контралатерального сегмента конечности соответственно. Верхний индекс — уровень значимости различий (р) по сравнению со здоровыми животными.

Таблица 2

Содержание общих липидов (% от массы сырой ткани) в скелетных мышцах собак при оперативном удлинении костей голени (Медиана; 25-й÷75-й процентили)

Этап эксперимента		Дистракция		Фиксация		После снятия аппарата
мышца	Здоровые животные (n = 6)	14-е cутки (n = 5)	28-е сутки (n = 5)	15-е сутки (n = 5)	30-е сутки (n = 5)	1-й месяц (n = 5)	6-й месяц (n = 5)
ОПБ	1,92	1,57 1,30÷1,84	1,92 1,60÷2,80	2,97 2,09÷3,99	2,83 2,01÷4,19	2,37 1,84÷2,76	1,74 1,39÷2,09
КПБ	1,38÷2,10	2,08 1,69÷2,47	1,95 1,92÷2,54	2,94 2,55÷3,88	2,82 0,05 2,64÷2,93	1,96 1,92÷2,46	1,99 1,78÷2,15
ОИМ	3,02	4,15 3,98÷4,34	3,28 2,32÷3,33	2,40 0,05 1,53÷3,02	2,19 0,05 1,81÷2,40	1,87 0,01 1,63÷2,11	3,34 3,07÷4,16
КИМ	2,47÷3,78	2,74 2, 56÷2,93	2,43 1,92÷3,42	3,00 2,44÷2,96	2,07 0,03 1,80÷2,25	3,30 2,71÷3,44	2,80 2,44÷3,11

Примечание. ОПБ и КПБ — передняя большеберцовая мышца удлиняемого и контралатерального сегмента конечности соответственно; ОИМ и КИМ — икроножная мышца удлиняемого и контралатерального сегмента конечности соответственно. Верхний индекс — уровень значимости различий (р) по сравнению со здоровыми животными.

передняя большеберцовая мышца икроножная мышца

Рис. 2. Концентрация глюкозы (А, ммоль/л), лактата и пирувата (Б, ммоль/л) в сыворотке крови собак в динамике оперативного удлинения костей голени. Примечание: по оси ОХ – сроки эксперимента: 1 — 14-е сутки дистракции; 2 — 28-е сутки дистракции; 3 — 15-е сутки фиксации; 4 — конец фиксации (30-е сутки); 5 — 1 месяц после снятия аппарата. * — статистическая значимость различий по сравнению с нормой при р < 0,05

Рис. 1. Произведение лактат × пируват в скелетных мышцах удлиняемого и контралатерального сегмента конечности собак в условиях оперативного удлинения костей голени. Примечание: по оси ОХ — сроки эксперимента: 1 — 14-е сутки дистракции; 2 — 28-е сутки дистракции; 3 — 15-е сутки фиксации; 4 — конец фиксации (30-е сутки); 5 — 1 месяц после снятия аппарата; 6 — 6-й месяц после снятия аппарата

Таблица 3

Активность аспарагиновой (АсАТ) и аланиновой (АлАТ) аминотрансферазы в скелетных мышцах собак при оперативном удлинении костей голени (Медиана; 25-й÷75-й процентили)

Этап эксперимента		АсАТ, мккат/г белка		АлАТ, мккат/г белка
		ПББМ	ИКМ	ПББМ	ИКМ
Здоровые животные (n = 6)		0,108 0,099÷0,130	0,084 0,080÷0,107	0,276 0,264÷0,277	0,237 0,207÷0,250
14-е сутки дистракции (n = 5)	О	0,123 0,105÷0,197	0,145 0,093÷0,177	0,247 0,231÷0,271	0,206 0,199÷0,263
	К	0,099 0,080÷0,123	0,092 0,079÷0,112	0,243 0,224÷0,290	0,248 0,210÷0,293
28-е сутки дистракции (n = 5)	О	0,1790,05 0,174÷0,183	0,1950,05 0,192÷0,199	0,334 0,05 0,307÷0,360	0,2940,05 0,274÷0,314
	К	0,1560,05 0,146÷0,166	0,1680,05 0,158÷0,177	0,212 0,165÷0,268	0,3480,05 0,315÷0,381

Примечание. ПББМ — передняя большеберцовая мышца, ИКМ — икроножная мышца; О — оперированная (удлиняемая) конечность; К — контралатеральная конечность. Верхний индекс — уровень значимости различий (р) по сравнению со здоровыми животными. * — статистическая значимость различий по сравнению с контралатеральной конечностью при р < 0,05.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, на этапах оперативного удлинения костей голени у собак в скелетных мышцах удлиняемого и контралатерального сегмента в качестве энергетических источников использовались различные субстраты. В ПББМ удлиняемого сегмента конечности основным субстратом энергетического обмена являлся внутриклеточный источник — гликоген. В ПББМ контралатеральной конечности — внемышечные источники энергии, в основном глюкоза крови. В ИКМ оперированного и контралатерального сегмента конечности на этапе дистрак-

ции использовались внетканевые энергетические субстраты (глюкоза и липиды крови), на этапе фиксации — смешанные источники: внутриклеточные липиды, глюкоза крови и, возможно, триглицериды крови. Помимо этого, в ходе оперативного удлинения конечности между мышцами и печенью осуществлялся интенсивный обмен недоокисленных субстратов, обеспечивая их утилизацию из ткани и способствуя поддержанию в ней высокой интенсивности процессов энергетического обмена.