Суточная динамика содержания фенольных соединений и активности гвайакол-пероксидазы в листьях и цветках подкренаты Alchemilla и Veronica chamaedrys

В течение суток растения оказываются под влиянием сильных флуктуаций условий окружающей среды, и в первую очередь температуры. На территории Сибири такие перепады особенно выражены и достигают вне зависимости от времени года 15-20 °С.

Пероксидаза играет важную роль в стресс-адаптации, в том числе при гипотермическом влиянии (Rogozhin, 2004). Фермент использует перекись в качестве акцептора водорода, в то время как донором могут выступать различные соединения – цитохром с, нитриты, аскорбиновая кислота, индол, амины, также фенольные соединения (Dikson and Uebb, 1982; Fielder, 1976). На сегодяшний день гистохимически показана совместная локализация полифенолов и пероксидазной активности на ряде видов растений, причем высокому содержанию фенолов сопутствуют конституционно высокие активности пероксидазы (Lavid et al., 2001). Широко известно, что стресс-толерантные растения обычно содержат высокий конститутивный уровень защитных метаболитов, в то время как более чувствительные растения показывают их индукцию под стрессом. Фенолы, танины и пероксидазная активность у многих растений участвуют в полимеризации полифенолов при защите от стресса, вызванного тяжелыми металлами (Lavid et al., 2001) и у устойчивых растений при вторжении патогена (Rogozhin, 2004). Ферменты, вовлекаемые в полимеризационные процессы фенолов – это фенолоксидазы: такие как лакказа, полифенолоксидаза и пероксидаза. Sherman с соавторами (1991) показали, что накопление полифенолоксидазы, широко распространенной в наземных растениях, но не водорослях, может происходить одновременно с адаптацией к окислительной атмосфере, где активность полифенолоксидазы жизненно необходима в фотосинтетическом аппарате, уязвимом к атмосферному кислороду. Также фотосинтез может играть косвенную роль, снабжая перекисью водорода (побочным продуктом фотосинтеза) реакцию полимеризации полифенолов пероксидазой, как предположено Yamasaki и др. (1997).

Манжетка богата танинами и особенно накапливает их к осени (Zorina, 2009), и обладает развитыми клеточными стенками, что должно давать ей адаптивные преимущества. Поэтому изучение в манжетке полифенолов и активности ферментов, участвующих в их метаболизме, представляется весьма интересным.

Соответственно целью наших исследований было изучить динамику фенольных соединений и активности слабосвязанных с клеточной стенкой и растворимых гваяколпероксидаз в листьях манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser в условиях суточных перепадов температур атмосферного воздуха в сравнении с другим лекарственным растением – вероникой дубравной Veronica chamaedrys L.

MATERIALS AND METHODS

Исследовались листья и соцветия манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser и вероники дубравной Veronica chamaedrys L., собранные в пойме реки Выдринная, в шестистах метрах от уреза оз. Байкал, левый берег реки на территории стационара СИФИБР «Речка Выдриная», разнотравный луг. Учитывая динамику температурного режима, пробы отбирались в третьей декаде июня в 8-9 часов после суточного минимума температур, в 14-15 во время максимально высокой температуры и в 20-21 ч на вечернем спаде температуры. Отбирались средневзвешенные образцы в трех повторностях в течение суток утром, в обед и вечером. Все биохимические исследования проводили в трех аналитических повторностях. С целью уменьшения возможных автолитических изменений образцы фиксировали в жидком азоте. Выделение гваяколпероксидаз осуществляли так, как описано в работе (Graskova, 2004). Выделение фенольных соединений осуществляли тройным экстрагирования кипящим 80% метанолом и очисткой объединенного экстракта хлороформом от липофильных пигментов по стандартной методике с последующей экстракцией фенольного комплекса этилацетатом. Общее содержание определяли спектрометрическим методом с помощью реактива Фолина-Дениса при 720 нм (Zaprometov, 1971) с помощью SPECORD S 100 («Analytikjena», Германия). Для построения калибровочной кривой использовали коммерческий препарат кверцитина («Sigma», США). Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием компьютерных программ StatSoft (Statistica 6,0).

RESULTS AND DISCUSSION

Средние значения и стандартные отклонения общего содержания фенольных соединений и активности слабосвязанной с клеточной стенкой, растворимой и общей гваякол-зависимых пероксидаз в 9, 14 и 21 ч в листьях и соцветиях манжетки городковатой и вероники дубравной приведены в табл. 1.

Нами установлено, что содержание фенольных соединений и активность пероксидаз зависит не только от вида и органа растения, но и от времени суток. При этом во всех случаях наблюдается повышение активности общей гваякол-зависимой пероксидазы в полуденную жару, что может свидетельствовать о высокотемпературном стрессе растений в это время суток.

Как правило, активность слабосвязанной с клеточной стенкой фракции пероксидаз ниже, чем общей и растворимой пероксидазы, однако динамика их суточных изменений чаще всего одинакова. Активность пероксидаз в генеративных органах (соцветиях) заметно отличается от активности в вегетативных органах (листьях).

В цветках манжетки активность растворимой и общей пероксидазы выше, чем в листьях, а активность пероксидазы слабосвязанной с клеточной стенкой, наоборот, ниже. Активность пероксидаз у вероники заметно ниже, чем у манжетки, и в ее листьях значения активности пероксидазы выше, чем в цветках, что свидетельствует о значительных видовых различиях этих растений.

Динамика содержания фенольных соединений также демонстрировала выраженную видо- и тканеспецифичность. У вероники содержание фенольных соединений в соцветиях в каждый временной отрезок было стабильно выше, чем в листьях, но при этом их динамика совпадала и максимум приходился на 9 ч утра с последующим уменьшением в течение дня. Соцветия манжетки продемонстрировали наряду с высокой активностью гваякол-пероксидазы стабильно высокие содержания фенольных соединений в течение всех суток, в то время как в листьях этого растения в 15 ч наблюдалось скачкообразное увеличение содержание полифенолов с последующим минимумом в 21 ч при относительно слабом росте активности фермента, окисляющего фенолы.

Table 1. Активность гваякол-зависимых пероксидаз и общее содержание фенольных соединений в листьях и соцветиях манжетки городковатой и вероники дубравной в разное время суток

CONCLUSIONS

Исследовались листья и соцветия манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser и вероники дубравной Veronica chamaedrys L собранные в пойме реки Выдриная, в шестистах метрах от уреза оз. Байкал. На примере двух видов лекарственных растений показаны существенные изменения содержания фенольных соединений и активности пероксидаз в зависимости от времени суток.

ACKNOWLEDGMENT

Работа выполнена при поддержке

Интеграционной программы «Фундаментальные исследования и прорывные технологии как основа опережающего развития Байкальского региона и его межрегиональных связей».