Световая и сканирующая электронная микроскопия суставного хряща при автоматическом удлинении голени

В связи с широким применением в ортопедии и травматологии метода дистракционного остеосинтеза важное место занимает проблема сохранения функциональных возможностей суставов, так как ограничение движений, если оно длительно, влечет за собой развитие деструктивных процессов в суставном хряще [6, 13, 17].

Кроме того, при удлинении конечности, в суставах, смежных с удлиняемым сегментом, всегда создается дополнительное давление [5], которое влечет за собой целый комплекс изменений: понижение концентрации протеогликанов в матриксе, уменьшение массы хрящей [16]. Одним из моментов, обусловливающих эти метаболические нарушения, является отсутствие в неподвижном суставе перемешивания синовиальной жидкости, приводящее к ослаблению трофических потенций хряща [8].

Структура поверхностной зоны суставного хряща, непосредственно контактирующая с синовиальной жидкостью, привлекает наибольшее внимание исследователей [8, 14, 15]. Суставная поверхность рассматривается не как инертный бесструктурный слой, а как подвижная динамическая структура, выполняющая определенную роль в механизме трения [8].

Работы по изучению морфологии суставного хряща в условиях дозированного удлинения голени малочисленны [4, 9, 10].

Учитывая вышеизложенное, целью настоящего исследования явилось изучение рельефа суставной поверхности и гистоморфометриче-ских характеристик хряща в условиях автоматического удлинения голени.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследован суставной хрящ наружных мыщелков бедренной кости 12 собак – 9 опытных и 3 интактных (контроль). В опытной серии после закрытой флексионной остеоклазии берцовых костей в течение 4 недель осуществляли дозированное удлинение правой голени аппаратом Илизарова с автоматическим приводом с темпом 1 мм в день (с 8 до 20 часов) за 60 приемов. Исследования проводили через 28 дней дистракции, 30 дней фиксации, 30 дней после снятия аппарата.

Визуально оценивали состояние суставных поверхностей. Для световой микроскопии образцы хряща после альдегидно-осмиевой фиксации дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, заключали в аралдит. Для получения репрезентативных препаратов при резко выраженной вертикальной анизоморфии суставного хряща кусочки ориентировали так, чтобы плоскость среза была перпендикулярна суставной поверхности. Полутонкие срезы толщиной 0,5-1,0 мкм готовили на ультрато-ме "Nova" фирмы LKB (Швеция) и окрашивали метиленовым синим или метиленовым синим-основным фуксином [11]. Микропрепараты исследовали на фотомикроскопе фирмы "Оpton" (Германия) с аппаратно-программным комплексом "ДиаМорф" (Москва). В программах той же фирмы изображения оцифровывали и морфо-метрировали. Измерения проводили в микро

РЕЗУЛЬТАТЫ И

При исследовании суставного хряща интактных животных макроскопически отмечали блестящие гладкие суставные поверхности жемчужно-белого цвета.

При изучении в СЭМ рельеф поверхности суставного хряща имел регулярную волнистость (рис. 1, а) и соответствовал описанной в литературе стереоультраструктуре интактной суставной поверхности мыщелков бедренной кости [8, 15].

При светооптическом исследовании отчетливо выражена зональная структура суставного хряща. Присутствовала бесклеточная пластинка (lamina splendens), межклеточное вещество поверхностной зоны было гомогенным.

Клетки продолговатой формы располагались в четко выраженных лакунах, вытянутых по направлению хода волокон, параллельно поверхности хряща (рис. 1, б).

В средней зоне наблюдались многочисленные хондроциты округлой формы, изогенные группы клеток. Увеличена интенсивность окраски межклеточного вещества вокруг изогенных групп (территориальный матрикс).

Базальная зона была относительно бедна хондроцитами, которые располагались колон- метрах после предварительной геометрической калибровки по оцифрованной с тем же увеличением шкале объект-микрометра. При оценке объемных отношений структур исходили из принципа А.Delesse (1847) VVi = AAi [7]. Определяли высоту (h) хряща и h поверхностной зоны, в поле зрения подсчитывали число следов хондроцитов, площади их и межклеточного вещества, рассчитывали объемную (VVхц) и численную (NAхц) плотности всех хондроцитов, численную плотность пролиферировавших хондроцитов (NAпхц) и величину их пула – выраженное в процентах отношение NAпхц/NAхц1 [2]. В качестве контроля морфометрировали суставной хрящ интактных животных. Анализ цифрового материала был проведен методами вариационной и непараметрической статистики. Достоверность различий оценивали в программе Microsoft Excel 97 по W-критерию Вилкоксона (для параметров - VVхц, NAпхц) и критерию Стьюдента (для параметров - h хряща, h поверхностной зоны) [1, 3, 12].

Для сканирующей электронной микроскопии ( СЭМ ) материал дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации, пропитывали в камфене², высушивали на воздухе, напыляли серебром, изучали в микроскопе “JSM-840” (исследовано 48 сканограмм).

ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ками, выявлялись гипертрофированные клетки. Базофильная линия (tidemark) извилистая, непрерывная, отчетливо выражена.

К концу дистракции макроскопически суставной хрящ был жемчужно-белого цвета, местами шероховатый. При изучении в СЭМ отмечали углубления, вдавления, неровности суставной поверхности, на отдельных участках отсутствовала бесклеточная пластинка (рис. 2, а).

При количественном морфологическом исследовании выявлено уменьшение высоты суставного хряща в среднем на 26 % по сравнению с контролем (табл. 1). Сохранялась зональная структура, за исключением разрушения бесклеточной пластинки.

а

б

Рис. 1. Суставной хрящ: а - поверхность, обращенная в суставную полость. СЭМ. Увеличение 600; б – поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Увеличение 500

В поверхностной зоне в части наблюдений отмечали деструктивные изменения: гибель отдельных клеток, нарушение гомогенности межклеточного вещества, появление зернистости, разволокнение суперфициальной 1/3 поверхностной зоны (рис. 2, б). Обнаружено статистически достоверное (р<0,05) уменьшение численной плотности хондроцитов по сравнению с контролем. Выявлены пустые лакуны. Объемная плотность хондроцитов в 1,7 раза была ниже, чем в контроле (табл. 1).

В средней зоне отмечено увеличение количества двух-, четырехчленных изогенных групп, что косвенно указывало на повышение пролиферативной активности клеток. Величина пула пролиферировавших хондроцитов на 24 % выше контроля (табл. 1).

а

б

Рис. 2. Суставной хрящ: а - поверхность, обращенная в суставную полость. СЭМ. Увеличение 500; б – поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Увеличение 500

В базальной зоне была отчетливо выражена базофилия территориального матрикса, что косвенно свидетельствовало о повышении функциональной активности хондроцитов. Базофильная линия не нарушена.

Через месяц фиксации суставной хрящ был матовый, местами истончен, с бледнофиолетовыми пятнами.

При изучении в СЭМ изменения рельефа суставной поверхности еще более выражены: отмечали появление очагов разволокнения, многочисленные вскрытые лакуны хондроцитов как пустые, так и с обнаженными клетками (рис. 3, а).

Таблица 1

Количественные характеристики хрящевой ткани суставной выстилки бедренной кости при автоматическом удлине- нии голени

Параметры	Контроль	Срок эксперимента
		Д 28	Ф 30	БА 30
VVхц (%, М)	9	5	8,23	8,38
NA хц (M ± m)	6,1 ± 0,79	3,8 ± 0,7	5,9 ± 0,5	5,3 ± 0,6
h поверхн. зоны хряща (мкм, M ± m)	105 ± 2	63 ± 0,6	90 ± 1,2	100 ± 1,5
h хряща (мкм, M ± m)	475 ± 1,3	356 ± 1,5	392 ± 2,1	464 ± 6,5
Величина пула пхц (%)	29	53	50	57

Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные различия с контролем (р < 0,05).

При количественном исследовании микропрепаратов наблюдалось достоверное (p < 0,05) уменьшение высоты хряща на 18 % по сравнению с контролем (табл. 1). Отсутствовала бесклеточная пластинка, была нарушена гомогенность межклеточного вещества, выявлены участки разволокнения 2/3 поверхностной зоны (рис. 3, б). Некоторые хондроциты отличались большими размерами и округлой формой (рис. 3, б).

а

б

Рис. 3. Суставной хрящ: а - поверхность, обращенная в суставную полость. СЭМ. Увеличение 1700; б – поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Увеличение 500

В средней и базальной зонах численная плотность хондроцитов на 7 % меньше, чем в контроле. Обнаружено достоверное (р<0,05) повышение объемной плотности хондроцитов по сравнению с предыдущим сроком эксперимента, различия с контролем по этому параметру недостоверны (р>0,05). Сохраняется повышенное количество молодых изогенных групп по сравнению с контролем. Об активной пролиферации хондроцитов свидетельствует их близкое расположение в изогенных группах, отсутствие сформированного территориального матрикса вокруг клеток. Величина пула пролиферировавших хондроцитов на

21 % выше контроля (табл. 1).

Через 30 дней после снятия аппарата отмечали блестящие гладкие суставные поверхности жемчужно-белого цвета. При изучении в СЭМ патологические очаги не выявлены (рис. 4, а).

При количественном исследовании высота хряща была увеличена на 24 % по сравнению со сроком 28 дней дистракции и существенно не отличалась от контроля (р>0,05). Структура не нарушена, восстановлена бесклеточная пластинка, выявлялась гомогенность межклеточного вещества поверхностной зоны (рис. 4, б).

а

б

Рис. 4. Суставной хрящ: а - поверхность, обращенная в суставную полость. СЭМ. Увеличение 1100; б – поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Увеличение 500

В средней зоне сохранялось повышенное количество двух- и четырехчленных изогенных групп клеток. Величина пула пролиферировавших хондроцитов составляла 57 %. Морфометрический анализ выявил, что объемная и численная плотность хондроцитов по зонам существенно (р>0,05) не отличалась от контроля (табл. 1). Базофильная линия была отчетливо выражена, непрерывна.

ВЫВОДЫ

Изменения структуры суставного хряща при удлинении голени состоят в деструкции поверхностной зоны хряща. Наблюдаемое уже на этапе дистракции в автоматическом режиме повышение пролиферативной и биосинтетической активности хондроцитов в средней и ба- зальной зонах направлено на пластическое обеспечение репарации поверхностной зоны [6].

Через месяц после снятия аппарата возврат к двигательному стереотипу способствовал реституции суставной поверхности.

Полученные результаты согласуются с литературными данными о трофическом влиянии функциональной нагрузки на суставной хрящ [6, 16] и подтверждают, что динамические нагрузки являются необходимым условием сохранения структурной организации суставного хряща.

Примененный комплекс методов световой микроскопии полутонких срезов, сканирующей электронной микроскопии, компьютерной мор-фо- и стереометрии позволил объективно оценить характер и объем изменений рельефа суставной поверхности, их связи с другими зонами хряща.

Полученные сведения о динамике развития деструктивных изменений хрящевой ткани указывают на необходимость учитывать состояние суставного хряща при удлинении голени и предупреждать развитие в нем патологических процессов.