Связь цитогенетических показателей с молекулярно-генетическими различиями у видов рода Rhododendron L. при интродукции

Древесные растения все больше привлекают внимание исследователей

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ «Исследование мутабильности семенного потомства интродуцентов на примере Rhododendron ledebourii Pojark.» (проект ¹ 14-34-50505).

в связи с перспективами вовлечения этих биологических объектов в сферу применения био- и геномных технологий для решения задач экологии, сохранения биоразнообразия, продовольственной и сырьевой обеспеченности, в связи с чем актуализируется необходимость изучения цитологических и молекулярно-генетических основ наследственности у таких растений.

В настоящее время в России цитогенетические характеристики достаточно широко исследуют у видов хвойных (1), особенно у представителей семейства Pinaceae (2-4). Среди лиственных растений изучаются аборигенные виды, например Betula pendula (5-7), Quercus robur (8), а также интродуцированные формы, такие как Catalpa, Tilia (9), Rhododendron (10-12). У древесных растений показано изменение ряда цитогенетических характеристик (в частности, митотической активности, которая может возрастать и снижаться в зависимости от интенсивности стрессовых нагрузок), увеличение частоты патологий митоза и др. На цитогенетические показатели семенного потомства древесных растений влияют химические поллютанты (5, 13), радиационное загрязнение (14), тяжелые металлы (4, 15, 16). Цитогенетические реакции в стрессовых условиях у семенного потомства многих древесных растений сходны, что вызывает вопросы об их видоспе-цифичности (или неспецифичности) и зависимости от внешних факторов. При этом попытки выявить сходство и различия цитогенетических особенностей древесных растений на основании результатов молекулярно-генетического сравнения не предпринимались.

Последовательности внутренних транскрибированных спейсерных областей (ITS) ядерной рибосомной ДНК использовались для создания филогенетической гипотезы разделения видов древecных растений рода Aralia (17), уточнения систематического положения Rhododendron (18), других родов семейства Ericaceae (19). Оценка молекулярно-генетического подобия видов проводится не только в целях изучения филогении (на основании сравнения последовательностей ДНК) (20-24), биогеорафии (25), но и в работах по биотехнологии (26, 27), биоинженерии (28), для выявления генетических маркеров (29), подтверждения гибридного статуса и различий донорских родительских форм у декоративных гибридов, в том числе видов Rhododendron (30). Так, ISSR маркер использовали для разделения групп одного и того же вида по различным признакам, например по изменению активности ферментов в ответ на химический стресс (31).

Выбор видов Rhododendron в качестве объекта исследований обусловлен тем, что сейчас эти растения активно изучаются с точки зрения молекулярной систематики (20, 22, 31, 32), генетического разнообразия (34-36) и хемосистематики (37, 38), тогда как сведения об их цитогенетических особенностях отрывочны (39) и в основном ограничиваются оценкой плоидности (10, 11). Проводились подробные исследования по цитологии рододенрона канадского ( Rhododendron canadense (L.) Torr.) (12). В современной классификации для видов Rh. mucronulatum Turcz., Rh. dauricum L., Rh. ledebourii Pojark. и Rh. sichotense Pojark. указана подсекция Rhodorastrum (Maxim.) Cullen, секция Rhododendron , подрод Rhododendron (35, 40). Очевидно, что для установления генетического сходства и различия видов одной подсекции, близких по морфологии, необходимы сравнительные исследования нескольких групп параметров.

Сокращение численности и уменьшение генетического разнообразия рододендронов в естественных условиях становится причиной снижения и адаптивного потенциала растений, а сложность идентификации видов этих красивоцветущих кустарников по морфологическим признакам, в свою очередь, затрудняет работу по сохранению биоразнообразия этих видов. Выяс-512

нение того, насколько молекулярно-генетическое сходство обусловливает цитогенетические реакции в условиях интродукции, позволит лучше понимать механизмы адаптации растений к среде обитания для поддержания их биопотенциала в искусственных условиях.

Мы впервые провели анализ ITS1-ITS2 последовательностей и сравнили молекулярно-генетические и цитологические особенности серии Dauricum подсекции Rhodorastrum (Maxim.) Cullen (секция Rhododendron , подрод Rhododendron ), а также выявили видоспецифичность цитогенетических характеристик у четырех изученных видов рододендрона при интродукции в условиях Центрально-Черноземного региона России .

Цель работы заключалась в изучении цитогенетических и молекулярно-генетических особенностей видов рододендрона в условиях, нетипичных для их естественного произрастания.

Методика . Использовали семена группового сбора четырех видов рода Rhododendron: Rh. mucronulatum Turcz., Rh. dauricum L., Rh. ledebourii Pojark. и Rh. sichotense Pojark., интродуцированных в Ботаническом саду им. Б.М. Козо-Полянского Воронежского государственного университета (географические координаты: 39°22' северной широты, 51°40' восточной долготы, высота над уровнем моря 168,2 м) . Возраст анализируемых растений 30-35 лет. Выборка состояла из 5 растений каждого вида. Для молекулярно-генетических исследований отбирали листья растений.

ДНК выделяли с использованием СТАВ буфера (1,5 M NaCl, 20 мM Na3-EDTA, 100 мМ HEPES рН 5,3, 25 °С, 1,5 % СТАВ) по протоколу PrimerDigital Oy . Участок ITS1-ITS2 ампли-фицировали с праймерами ITS5 (5´-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3´) и ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) (41), синтезированными в «Eu-rofins MWG, Inc.» (Германия) . Для амплификации фрагментов ITS1-ITS2 использовали стандартный протокол для Taq ДНК-полимеразы. Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 25 нг ДНК, 1½ DreamTaq буфер (с 1,5 мМ MgCl2), 0,2 мМ dNTPs, 0,3 мкM каждого праймера и 1 ед. DreamTaq ДНК-полимеразы («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США), в амплификаторе MasterCycler Gradient («Eppendorf AG», Германия): начальная денатурация 3 мин при 95 °С; 20 циклов — 15 с при 95 °С, 60 с при 60 °С, 30 с при 72 °С; завершающая элонгация — 5 мин при 72 °С.

Амплифицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле (RESolute Wide Range, «Biozym Scientific GmbH», Германия), продукты визуализированы бромистым этидием. Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (GeneRuler DNA Ladder Mix, #SM0331, «Thermo Fisher Scientific, Inc.», США).

Фрагменты ДНК экстрагировали из агарозного геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit («Qiagen, Inc.», США). Лигирование фрагментов ПЦР-продуктов в плазмидный T-вектор pGEM-T («Promega, Inc.», США) выполняли согласно протоколу производителя. Плазмидной ДНК трансформировали клетках Escherichia coli штамма JM109 («Promega, Inc.», США). Клетки, несущие плазмиду со вставкой, детектировали посредством бело-синей селекции на среде с ампициллином (в конечной концентрации 100 мкг/мл), хромогенным субстратом 5-бром-4-хлор-3-ин-долил-p-D-галактопиранозидом (X-Gal, 20 мг/мл) и изопропил- в -D-1-тио-галактопиранозидом (IPTG, 200 мг/мл). Проверку колоний на наличие вставки ПЦР-продуктов, клонированных в векторе, проводили с помощью ПЦР с универсальными pUC праймерами (M13, прямой и обратный).

Сервис по секвенированию последовательностей амплифициро- ванной ДНК был предоставлен лабораторией ДНК-секвенирования Института биотехнологии (университет Хельсинки; . Использовался капиллярный секвенатор 3730xl DNA Analyzer («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Данные по ITS1-ITS2 участкам получили для видов Rh. mucronulatum Turcz., Rh. dauricum L., Rh. ledebourii Pojark. и Rh. sichotense Pojark, произрастающих в условиях интродукции в Центральном Черноземье. Кластерный анализ нуклеотидных последовательностей и построение дендрограммы проводили методом ML (Maximum Likelihood, Nearest-Neighbor-Interchange) в программе MEGA v.6 (23, 24).

Для цитогенетических исследований семена рододендронов проращивали в чашках Петри при комнатной температуре. По достижении корешками длины 0,5-1 см их фиксировали (в 9 ч утра) в ацетоалкоголе (смесь 96 % этилового спирта и ледяной уксусной кислоты, 3:1), после чего материал хранили в холодильнике при температуре +4 °С. Корешки проростков подвергали мацерации в 18 % растворе HCl при 60 °С в течение 1-2 мин, затем 15 мин промывали в 45 % уксусной кислоте, окрашивали ацетогематоксилином в течение 1-1,5 ч, ополаскивали дистиллированной водой и готовили давленые микропрепараты с использованием жидкости Гойера. Препараты (по 20 для каждого вида рододендрона) изучали с помощью микроскопа LABOVAL-4 («Carl Zeiss, Inc.», Швейцария) при общем увеличении 40½1,5½10.

В каждом микропрепарате (один препарат соответствует одному корешку и одному проростку) исследовали около 500-700 клеток. Всего просмотрели около 42500 клеток изучаемых видов рода Rhododendron . На микропрепаратах анализировали следующие цитогенетические показатели: митотическую активность (митотический индекс МИ — отношение числа делящихся клеток к общему числу подсчитанных клеток, %), процентное соотношение числа клеток по стадиям митоза, частота патологий митоза (отношение числа клеток с нарушениями к общему числу делящихся клеток, %), доля клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы— анафазы митоза (отношение числа клеток с остаточными ядрышками к общему числу клеток на указанных стадиях, %). Классификацию патологических митозов проводили по И.А. Алову (42).

Компьютерную статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Stadia v.7.0 , «TechSmith Corporation», США). Процедура группировки данных и их обработка изложены А.П. Кулаичевsv (43). Для выражения значений каждого цитогенетического показателя использовали среднюю с ошибкой средней (х±SEM). Выборки сравнивали по частоте патологий митоза и доле клеток с остаточными ядрышками, используя Х-критерий рангов Ван-дер-Вардена, так как анализируемые признаки не подчиняются нормальному распределению. Различия считали статистически значимыми при Р < 0,05, Р < 0,01. Кластерный анализ выполняли с использованием метрики нормированного евклидова расстояния и стратегии классификации группового соседа. В матрицу данных для кластерного анализа включали следующие цитогенетические показатели семенного потомства: МИ, подсчитанный с учетом клеток на стадии профазы (%), МИ, подсчитанный без учета клеток на стадии профазы (%), доля (%) клеток в профазе, клеток в метафазе, клеток в ана-телофазе, частота патологий митоза (%), доля клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы— телофазы митоза (%).

Результаты . Данные молекулярно-генетического анализа ITS1-ITS2

последовательностей представлены на дендрограмме (рис. 1). Видно, что Rh. mucronulatum и Rh. dauricum имеют идентичную ITS1-ITS2 последовательность. У Rh. ledebourii с Rh. mucronulatum и Rh. dauricum различия по ITS1-ITS2 последовательности составили 1 нуклеотид, между Rh. sichotense и Rh. mucronulatum , Rh. sichotense и Rh. dauricum разница по ITS1-ITS2 последовательности составляла 2 нуклеотида. Различия между Rh. ledebourii и Rh. sichotense для спейсера ITS1-ITS2 соответствовали 3 нуклеотидам.

72 I №. daurtcum

__________________________ 1 Rh mucronulatum ------------------------Rh. ledebourti

-I------------------------1------------------------1------------------------1

0,015          0,0010          0,0005            0

Рис. 1. Нуклеотидные различия по ITS1-ITS2 последовательности у видов рода Rhododendron L. (метод Maximum Likelihood, Nearest-Neighbor-Interchange, программа MEGA v.6).

В таблицах 1 и 2 представлены цитогенетические показатели изученных видов рода Rhododendron

Клеточное деление — высококанализо-ванный процесс (8). У видов рододендронов, ко- торые мы проанализировали, показатели митоза варьировали (см. табл. 1).

1. Цитогенетические характеристики видов рода Rhododendron ( х± SEM)

Вид	МИ, %	Число клеток, %
	c учетом профаз без учета профаз	в профазе в метафазе в ана-телофазе

Rhododendron dauricum L.	7,6±0,3	3,9±0,2	48,9±2,0	13,3±1,4б	41,7±2,3
Rh. mucronulatum Turcz.	7,7±0,7	4,9±0,7	37,5±1,9 ∗ в	10,2±0,9 ∗∗	51,9±1,4 ∗
Rh. sichotense Pojark.	5,6±0,7 ∗ а	3,0±0,4 ∗ а	45,8±1,1	14,6±2,2	39,6±3,2 ∗∗ б
Rh. ledebourii Pojark.	6,1±0,6 ∗	3,8±0,4	37,9±1,9 ∗∗ г	18,7±2,1 ∗	43,4±1,7

П р и м е ч а н и е. МИ — митотический индекс.

^∗∗ Различия с Rhododendron dauricum статистически значимы соответственно при Р < 0,05 и P < 0,01.

^а — различия с Rh. mucronulatum статистически значимы (P < 0,05); ^б — различия с Rh. mucronulatum статистически значимы (P < 0,01); ^в — различия с Rh. sichotense статистически значимы (P < 0,05); ^г — различия с Rh. sichotense статистически значимы (P < 0,01).

2. Цитогенетические аномалии видов рода Rhododendron ( х± SEM)

Вид	Патологические митозы, % Клетки с остаточными ядрышками, %
Rhododendron dauricum L. Rh. mucronulatum Turcz. Rh. sichotense Pojark. Rh. ledebourii Pojark.	1,6±0,4                                  10,2±1,0 3,4±0,3                                  9,1±1,1 3,5±0,5                                  13,3±1,2а 5,2±1,1 ∗                                    10,9±1,3в

^∗ Различия с Rhododendron dauricum статистически значимы при Р < 0,05.

^а — различия с Rh. mucronulatum статистически значимы (P < 0,05); ^в — различия с Rh. sichotense статистически значимы (P < 0,05).

Так, среди семенного потомства можно выделить две группы по митотической активности: первая — Rhododendron dauricum и Rh. mucronula-tum с высоким значением МИ в корневой меристеме проростков (соответственно 7,6±0,3 % и 7,7±0,7 %), вторая — Rh. sichotense и Rh. ledebourii с соответствующими низкими показателями (5,6±0,7 % и 6,1±0,6 %). Анализ распределения клеток по стадиям митоза показал, что изученные виды сгруппировались следующим образом. Число клеток на стадии профазы у Rh. dauricum (48,9±2,0 %) и Rh. sichotense (45,8±1,1 %) было значительным, а у Rh. mucronulatum (37,5±1,9 %) и Rh. ledebourii (37,9±1,9 %) — невысоким. Повышенный процент профазных клеток свидетельствует о возможных нарушениях митотического аппарата (44) и активации системы checkpoint-контроля целостности генетического материала (45). Подобные цитологические ответы мы можем объяснить индивидуальными (видоспецифическими) особенностями растений. Виды Rh. mucronulatum и Rh. daur-icum, не имеющие молекулярно-генетических различий по последовательности ITS1-ITS2, входят в группу с высокими значениями митотического индекса, подсчитанного с учетом клеток на стадии профазы. Rh. ledebourii и Rh. sichotense, отличающиеся друг от друга по последовательности ITS1-ITS2, принадлежат к группе с меньшими МИ.

Число клеток на стадии метафазы митоза было максимальным у Rh. ledebourii (18,7±2,1 %) и Rh. sichotense (14,6±2,2 %), минимальным — у Rh. mucronulatum (10,2±0,9 %) и Rh. dauricum (13,3±1,4 %). Задержка клеток на стадии метафазы может свидетельствовать о нарушении формирования веретена деления (42). Группировка видов по времени прохождения стадии ана-телофазы митоза оказалась иной. Наибольшую долю клеток на этой стадии отмечали у Rh. mucronulatum (51,9±1,4 %), у остальных видов эти значения были значительно ниже (см. табл. 1). Увеличение числа клеток на стадии ана-телофазы митоза свидетельствует о нарушении формирования клеточной стенки (44).

Наибольшую цитогенетическую нестабильность наблюдали у Rh. le-debourii (5,2±1,1 %, частота патологий митоза максимальная), у трех других видов она была ниже (от 3,5±0,5 % у Rh. sichotense до 1,6±0,4 % у Rh. da-uricum ) (см. табл. 2). Можно предположить, что в условиях интродукции генетическая система Rh. ledebourii наименее адаптирована. Спектр нарушений в основном был представлен отставаниями хромосом в анафазе и метакинезе. Мосты отмечались только у Rh. mucronulatum (25 % от общего числа патологий митоза) и Rh. sichotense (12 % от общего числа патологий митоза) . Более высокая доля клеток с остаточным ядрышком на стадии метафазы—телофазы митоза свидетельствует о большей интенсивности синтетических процессов (6), связанных с адаптацией в условиях интродукции. По этому показателю выделились две группы: первую образовал вид Rh. sichotense (13,3±1,2 %) с высоким процентом клеток с остаточным ядрышком на стадии метафазы—телофазы митоза, во вторую вошли Rh. mucronulatum (9,1±1,1 %), Rh. dauricum (10,2±1,0 %) и Rh. ledebourii (10,9±1,3 %) с меньшей долей таких аномалий.

5:

4‘ ______________ з-

1 ■

Ofc_____________________________________________________________

12    3    4

Рис. 2. Дендрограмма кластерных расстояний между видами рода Rhododendron L. по цитогенетическим характеристикам: 1 — Rh. dauricum , 2 — Rh. mu-cronulatum , 3 — Rh. sichotense , 4 — Rh. ledebourii (использована метрика нормированного евклидова расстояния и стратегия классификации группового соседа; показатели, включенные в матрицу данных, см. в разделе «Методика»).

Несмотря на различие цитогенетических показателей у семенного потом- ства изученных видов, кластерный анализ совокупности характеристик митоза и ядрышковой активности позволил выделить две группы (рис. 2): первая — Rh. mucronulatum и Rh. dauricum, вторая — Rh. ledebourii и Rh. sic-hotense. Наибольшее кластерное расстояние отмечалось между совокупностями цитогенетических показателей у Rh. mucronulatum и Rh. sichotense, наименьшее — между видами Rh. mucronulatum и Rh. dauricum, что согласу- ется с полученными нами данными молекулярно-генетических исследований, которые показали сходную группировку этих видов. При интродукции в Центральное Черноземье материнские растения изучаемых видов находились в одинаковых условиях (Ботанический сад им. Б.М. Козо-Полянского Воронежского государственного университета), поэтому можно говорить о проявлении видоспецифичности цитогенетических показателей их семенного потомства. Данные наших исследований о сходстве цитогенетических характеристик видов рода Rhododendron согласуются с результатами М.В. Белоусова с соавт. (37) по хемотаксономии, морфологии и анатомии, кото- рые показали наибольшее морфологическое (вторичное) сходство тех же видов и объясняли это сходными экологическими условиями в местах произрастания в естественных ареалах видов. Заслуживает внимания тот факт, что по молекулярно-генетическим и цитогенетическим характеристикам виды сгруппированы сходным образом. Кластерное расстояние, вычисленное на основании изучения цитогенетических свойств, между видами Rh. mucronulatum и Rh. dauricum наименьшее. Эти виды имеют одинаковую последовательность ITS1-ITS2, Rh. ledebourii отличается от них по одному нуклеотиду, Rh. sichotense — по двум нуклеотидам, что соответствует большему кластерному расстоянию между цитогенетическими показателями. Различие между Rh. ledebourii и Rh. sichotense для спейсеров ITS1-ITS2 составляет три нуклеотида. Однако разница по ITS-последовательности в 1-3 нуклеотида не играет значимой роли при определении молекулярно-генетических характеристик. Таким образом, сходство нуклеотидной последовательности у видов рода Rhododendron обусловливает их большую близость по совокупности цитогенетических особенностей.

Итак, идентичность нуклеотидной последовательности спейсера ITS1-ITS2 у видов рода Rhododendron серии Dauricum приводит к их большему сходству по совокупности цитогенетических показателей. Однако у видов, имеющих идентичную последовательность ITS1-ITS2, не отмечается полного совпадения цитогенетических характеристик. На основании выполненного нами сравнения можно предположить, что у изученных представителей рода Rhododendron серии Dauricum генетическая однородность обусловливает сходство цитогенетических свойств. Цитогенетические характеристики семенного потомства у исследованных форм видоспецифичны.