Связь параметров опухолевого неоангиогенеза с лимфогенным метастазированием при раке прямой кишки

Рак прямой кишки (РПК) является третьим по распространенности и четвертым по летальности злокачественным новообразованием в мире [1]. В зависимости от стадии процесса и локализации первичной опухоли определяется дальнейшая тактика и режим терапии РПК. Золотым стандартом лечения РПК является радикальная операция, которая при местнораспространенных опухолях сочетается с неоадъювантной химиолучевой терапией (НАХЛТ) [2]. Известно, что степень дифференцировки опухоли, а также распространенность и выраженность лимфогенного метастазирования при РПК считаются основными гистологическими прогностическими параметрами, способными влиять на результаты комбинированного лечения этой патологии.

В литературе уделяется все больше внимания дополнительным параметрам прогноза при РПК, среди которых особое значение придают определению плотности микрососудов в опухоли и ее связи с метастазированием и эффектами НАХЛТ. Основным условием для интенсивного роста первичного опухолевого узла является ангиогенез (неоангиогенез), характеризующийся формированием новых сосудов из существующих. Регуляция неоангиогенеза заключается в балансе между ингибирующими и стимулирующими факторам роста [3, 4]. Наряду с фактором роста фибробластов, трансформирующим фактором роста, фактором некроза опухоли и другими ангиопоэтинами рецептор эндотелиального сосудистого фактора роста (VEGFR) является мощным индуктором ангиогенеза. Данный процесс характеризуется последовательностью событий, начинающейся с расширения сосудов, отделения перицитов от сосудистой стенки с последующей пролиферацией эндотелиоцитов и формированием сосудистых клубочков, окруженных стромальными клетками. Оценка плотности микрососудов, а также «сосудистых почек» (кластеров эндотелиоцитов) – широко используемый метод для количественной оценки внутриопухолевого ангиогенеза [5]. CD34 – поверхностный антиген, экспрессирующийся в эндотелиальных клетках сосудов. Хотя CD34 обладает высокой чувствительностью и специфичностью, он не имеет избирательности в отношении эндотелия нормальных сосудов и сосудов опухоли. Другим иммуногистохимическим маркером для определения эндотелия микрососудов является CD 105 (эндоглин), экспрессирующийся только в эндотелии сосудов опухолевой ткани [6, 7]. Svagzdys et al., определяя плотность микрососудов после длительной лучевой терапии РПК, отметили, что период выживаемости увеличивался по мере уменьшения плотности сосудов в опухоли [8]. В исследовании Arimoto et al. показано, что прием бевацизумаба сопровождался уменьшением плотности микрососудов в опухоли прямой кишки [9]. Martins et al. установили, что экспрессия VEGF в случаях с метастазами и без таковых была одинаковой, тогда как по мере увеличения стадии РПК экспрессия данного маркера возрастала [10]. Кроме того, отмечена связь между экспрессией VEGF и метастатическим поражением лимфатических узлов при РПК. Выраженность экспрессии VEGF преобладала в группе пациентов с короткой общей выживаемостью в случае метастатического поражения лимфоузлов, тогда как экспрессия в группе с более продолжительной выживаемостью была менее интенсивна. При этом плотность микрососудов преобладала в случае выраженной экспрессии VEGF [11]. Имеются сведения о прогностической значимости плотности микрососудов при некоторых злокачественных новообразованиях, таких как рак мочевого пузыря, молочной железы, почечно-клеточный рак. В частности, известно, что неоадъювантная химиотерапия рака молочной железы сопровождается развитием выраженного антиангиогенного эффекта, проявлявшегося уменьшением плотности микрососудов. Данный феномен коррелирует с увеличением экспрессии антиангиогенных факторов, при этом экспрессия VEGF сохранена [12]. При раке мочевого пузыря экспрессия CD34 в эндотелии микрососудов ассоциирована с высокой частотой рецидивов опухоли [13].

Материал и методы

Исследовался операционный материал от 130 больных раком прямой кишки ypT_1—4N_0-2M 0 стадии, получавших комбинированное лечение в торакоабдоминальном отделении НИИ онкологии Томского НИМЦ в период с 2000 по 2015 г. Средний возраст составил 57,6 ± 9,3 года. Мужчин было 85 (65,3 %), женщин – 45 (34,7 %).

Морфологическому исследованию подвергалась ткань первичной опухоли. Материал фиксировался в 10-12 % растворе нейтрального формалина. Проводка материала и изготовление гистологических препаратов осуществлялись по стандартной методике. Препараты окрашивались гематоксилином и эозином. Исследование выполнялось с применением светового микроскопа «Carl Zeiss Axio Lab. A1» (Германия). Гистологический тип рака прямой кишки устанавливался согласно рекомендациям ВОЗ (2010). В исследование включались только случаи с аденокарциномой. В паренхиматозном компоненте опухоли отдельно в слизистой оболочке, подслизистой основе, мышечном и серозном/ адвентициальном слоях выделяли железистоподобные, криброзные, солидные структуры и дискретные группы опухолевых клеток.

Иммуногистохимическое исследование выполнялось по стандартной методике. Применялись антитела фирмы Dako к CD34 (Clone QBEnd 10) и anti-VEGFR2 (Mouse monoclonal [EIC] to VEGF Receptor 2). На разной глубине инвазии опухоли изучалась плотность микрососудов и «сосудистых почек» новообразования, визуализированных с помощью позитивной экспресси CD34 и VEGFR в эндотелии. Подсчитывалось количество микрососудов при увеличении ×400 в 10 полях зрения. В операционном материале исследовали все удаленные лимфатические узлы. В препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, выявляли их метастатическое поражение. Обработка полученных данных выполнялась с использованием пакета программ «Statistica 10». Применялся критерий χ2. Обсуждались результаты с достоверностью различий при р<0,05.

Результаты

При изучении плотности микрососудов и «сосудистых почек» в опухолевой ткани на различной

Рис. 2. Экспрессия VEGFR в опухолевых микрососудах и опухолевых структурах рака прямой кишки, ×400

Рис. 1. Экспрессия CD 34 в опухолевых микрососудах и «сосудистых почках», ×400

Таблица 1

Связь плотности микрососудов (экспрессия CD34) с лимфогенным метастазированием при раке прямой кишки

Глубина инвазии	Плотность микрососудов		F, р
	N o	N+
Слизистая оболочка	6,9 ± 5,2 (n=91)	6,6 ± 3,4 (n=39)	F=0,05; р=0,81
Подслизистый слой	5,8 ± 4,2 (n=91)	8,1 ± 7,0 (n=39)	F=3,2; р=0,01
Мышечный слой	5,3 ± 4,7 (n=91)	7,0 ± 6,1 (n=39)	F=0,2; р=0,13
Серозная оболочка	0,8 ± 0,4 (n=91)	1,7 ± 0,8 (n=39)	F=3,2; р=0,07
			Таблица 2
Связь плотности «сосудистых почек» (экспрессия CD34) с лимфогенным метастазированием при
	раке прямой кишки
Глубина инвазии	Плотность «сосудистых почек» No                         N +		F, р
Слизистая оболочка	4,0 ± 2,2 (n=91)	2,9 ± 2,6 (n=39)	F=1,18; р=0,27
Подслизистый слой	4,0 ± 3,2 (n=91)	3,9 ± 3,1 (n=39)	F=0,64; р=0,43
Мышечный слой	4,2 ± 3,4 (n=91)	3,8 ± 3,2 (n=39)	F=0,11; р=0,73
Серозная оболочка	0,6 ± 0,1 (n=91)	0,9 ± 0,2 (n=39)	F=0,50; р=0,47
			Таблица 3
Связь плотности микросоудов (экспрессия VEGFR) с лимфогенным метастазированием при раке
	прямой кишки
Глубина инвазии	Плотность N0	микрососудов N+	F, р
Слизистая оболочка	1,4 ± 0,9 (n=91)	1,8 ± 1,2 (n=39)	F=0,91; р=0,34
Подслизистый слой	1,4 ± 1,1 (n=91)	1,6 ± 1,2 (n=39)	F=0,36; р=0,54
Мышечный слой	1,2 ± 0,5 (n=91)	1,2 ± 0,2 (n=39)	F=0,02; р=0,88
Серозная оболочка	0,2 ± 0,1 (n=91)	0,6 ± 0,3 (n=39)	F=2,07; р=0,15

Таблица 4

Связь плотности «сосудистых почек» (экспрессия VEGFR) с лимфогенным метастазированием при раке прямой кишки

Глубина инвазии Плотность «сосудистых почек» F, р N0 N+ Слизистая оболочка 1,0 ± 0,9 (n=91) 1,2 ± 0,2 (n=39) F=0,91; р=0,34 Подслизистый слой 1,4 ± 1,1 (n=91) 1,3 ± 1,1 (n=39) F=0,06; р=0,80 Мышечный слой 1,2 ± 0,5 (n=91) 1,4 ± 0,3 (n=39) F=0,11; р=0,73 Серозная оболочка 0,3 ± 0,1 (n=91) 0,3 ± 0,2 (n=39) F=0,01; р=0,94 глубине инвазии с использованием антитела к CD34 (рис. 1) оказалось, что в подслизистом слое прямой кишки плотность микрососудов выше в случаях с наличием лимфогенных метастазов в сравнении с группой без лимфогенного метастазирования (8,1±7,0 и 5,8±4,2; F=3,2; р=0,01) (табл. 1).

Плотность микрососудов в слизистой, мышечной, серозной оболочках прямой кишки не различалась в группах с наличием или отсутствием лимфогенных метастазов. Плотность «сосудистых почек» во всех слоях стенки прямой кишки не была связана с лимфогенным метастазированием (табл. 2).

Изучение аналогичных параметров неоангиогенеза в аденокарциномах прямой кишки с использованием антитела к VEGFR (рис. 2) выявило, что плотность микрососудов в слизистой оболочке, подслизистом и мышечном слоях, серозной оболочке прямой кишки не различалась в группах с наличием или отсутствием лимфогенных метастазов (табл. 3). Плотность «сосудистых почек» во всех слоях стенки прямой кишки не была связана с лимфогенным метастазированием (табл. 4).

Заключение

Проведенное исследование показало, что экспрессия молекулярно-биологических маркеров неоангиогенеза в опухолевой ткани при аденокарциноме прямой кишки связана с параметрами лимфогенного метастазирования. Следует отметить, что целесообразно выполнять изолированную оценку экспрессионных параметров показателей неоангиогенеза CD34 и VEGFR в опухолевой ткани в разных слоях стенки кишки. Выявленная закономерность увеличения плотности микрососудов в опухолевой ткани в подслизистом слое прямой кишки, отмеченная при позитивной экспрессии антитела к CD34, была ассоциирована с лимфогенным метастазированием. Подобный феномен может указывать на повышенный риск развития этого варианта опухолевой прогрессии уже на ранних стадиях заболевания. Плотность микрососудов, оцененная с использованием антитела к VEGFR не была связана с высоким риском лимфогенного метастазирования, что, несомненно, требует дальнейшего пристального изучения этого маркера в отношении его ассоциации с параметрами опухолевой прогрессии.