Связь реакции растений томата на воздействие солевого стресса с особенностями регуляции биосинтеза фенольных соединений

Томат ( Solanum lycopersicum L., сем. Solanaceae ) — важная и популярная во всем мире овощная культура, на урожайность которой влияют различные стрессовые факторы. Географическим центром происхождения томата ( S. lycopersicum и другие родственные виды секции Lycopersicon ) считают тихоокеанское побережье западной части Южной Америки, для которого характерно сильное засоление почв (1-3). Дикорастущие виды томата обладают солеустойчивостью, однако она снизилась у культивируемого томата в процессе доместикации, поэтому засоление почв стало одним из основных абиотических стрессоров для современных сортов S. lycopersicum (1-3).

Избыточное содержание соли в почве создает осмотический и ионный дисбаланс в клетках растения, что приводит к оксидативному стрессу, изменениям метаболизма и, как следствие, нарушению прорастания семян и жизнеспособности растений (1). В связи с этим получение солеустойчивых сортов и гибридов остается одним из ключевых направлений селекции томата, особенно для сортов защищенного грунта.

Солеустойчивость может иметь генетические основы, а может быть следствием памяти растения о стрессе, которая возникает при первичном стрессовом событии (прайминг, или праймирование) и закрепляется повторными воздействиями стрессора на протяжении жизненного цикла (4). Прайминг изначально был известен как агротехнический прием, заключающийся в предпосевном замачивании семян в растворах с химическими или биологическими добавками для стимуляции развития и стрессоустой-чивости будущих растений (5-7). В настоящее время понятие прайминга охватывает не только семена, но и растения, находящиеся на разных стадиях развития (8-10). В применении к солевому стрессу праймингом для повышения солеустойчивости растений может служить как предпосевное замачивание семян в растворе соли, так и полив таким раствором рассады (10-12). Прайминг приводит к эпигенетическим модификациям, которые при повторных воздействиях засоления инициируют в растении необходимые транскрипционные, метаболические и другие изменения. При этом в отсутствие стресса геном способен вернуться в исходное состояние (13).

Известны две разновидности прайминга — цис-прайминг (одинаковая природа первичного и последующих стрессовых воздействий) и транс-прайминг (первичное воздействие стимулирует эффективный ответ растения на стрессовые факторы другого типа) (13, 14). Это означает, что для повышения солеустойчивости растений в качестве первичного стимула не обязательно должен использоваться избыток NaCl. Показано, что соле-устойчивость растений повышается после обработки растворами CaCl2, KCl, PEG (полиэтиленгликоль), H2O2, фитогормонов (салициловая и ацетилсалициловая кислоты, брассинолид), аскорбиновой кислоты, мелатонина, а также при прайминге воздействием обводнения, статического магнитного поля и других факторов (15, 16). Считается, что эффект транс-прайминга становится следствием сходной реакции транскриптома на ассоциированные типы стрессоров (13, 14, 16).

Память растения о стрессе как результат прайминга может быть как краткосрочной (проявляться в течение жизни), так и долгосрочной (наследоваться мейотически) (13, 17). В последнем случае растения становятся донорами признака и могут быть использованы в селекции солеустойчивых гибридов томата. Уже существующие сорта также могут быть улучшены посредством прайминга вплоть до появления у них наследуемой стрессовой памяти.

Значительная часть генов и метаболитов, участвующих в ответе растения на стрессор, служат маркерами стрессовой памяти, для которых характерно, в первую очередь, изменение экспрессии/содержания при прай-минге (18-20). Сравнение динамики содержания метаболитов и/или степени экспрессии генов памяти у образцов при стрессовом воздействии может быть полезно при селекции стрессоустойчивых сортов и гибридов, как было показано на примере отбора доноров засухоустойчивости среди образцов андского картофеля (21).

Механизм, лежащий в основе солеустойчивости томата, мало изучен, однако его рассматривают с учетом данных по другим видам растений (1). В числе прочего его связывают с содержанием фенольных соединений, которые синтезируются фенилпропаноидным путем, и активностью L-фе-нилаланин-аммоний-лиаз (PAL), которые катализируют первую стадию фе-нилпропаноидного пути, превращая фенилаланин в коричную кислоту (22). Например, у Platycodon grandiflorus в ответ на солевой стресс дифференциально экспрессируется около 9 тыс. генов, изменяется содержание более 400 метаболитов, при этом большинство последних представляют собой продукты флавоноидного метаболического пути (22, 23).

В настоящей работе с использованием различающихся по солеустой-чивости сортов томата отечественной селекции впервые определена динамика содержания фенольных соединений и экспрессии ключевых генов фе-нилпропаноидного (группа генов PAL5 ) и флавоноидного ( CHS2 ) путей в процессе воздействия на растения солевого стресса. Установлено, что в качестве биомаркеров наличия у растений томата стрессовой памяти могут использоваться концентрация фенольных соединений спустя 1 ч воздействия избытка NaCl и снижение экспрессии генов группы PAL5 спустя 24 ч воздействия.

Целью нашего исследования стала оценка возможных связей между солеустойчивостью растений томата и регуляцией биосинтеза фенольных соединений.

Ìåòîäèêà. Использовали образцы четырех сортов томата S. lycoper-sicum — Отрадный (код сорта 8006741), Гном (9401318), Фонарик (9608117) и VS-342-18 (сорт в процессе разработки/регистрации) селекции Федерального научного центра овощеводства (ФНЦО, Московская обл.) . По предварительным данным ФНЦО, сорта Отрадный и Гном могли обладать повышенной устойчивостью к избытку соли в почве, тогда как сорта Фонарик и VS-342-18 чувствительны к засолению. Растения из семян урожая 2023 года получали в экспериментальной установке искусственного климата (ФИЦ Биотехнологии РАН, Россия) при следующем режиме: 16 ч/8 ч (день/ночь), 23 °С/21 °С.

Взрослые растения в стадии сформированных 8-10 листьев подвер- гали воздействию солевого стресса. Для этого опытные и контрольные образцы извлекали из почвы и переносили в воду (время начала опыта — 800). Спустя 1 ч (900) опытные растения помещали в водный раствор, содержащий 100 мМ NaCl, для имитации солевого стресса; контрольные растения оставляли в воде.

Пробы (все листья с одного растения) отбирали в 10⁰⁰ (1 ч стресса), 15 00 (6 ч стресса) и 9 00 следующего дня (24 ч стресса) и хранили при - 80 ° С. Для каждой временной точки использовали по два индивидуальных растения (два биологических повтора) в контроле и опыте. Все листья с растения собирали, чтобы нивелировать эффект разной стадии физиологического развития. Для этого материал тщательно растирали и перемешивали в фарфоровой ступке пестиком с использованием жидкого азота, и для последующих анализов брали навеску. Пробы использовали для анализа содержания фенольных соединений и экспрессии ключевых генов фенилпропано-идного и флавоноидного путей.

Содержание фенольных соединений определяли по E.A. Ainsworth с соавт. (24). Собранные с одного растения целые листья измельчали растиранием в фарфоровой ступке пестиком с использованием жидкого азота. К навеске массой 20 мг добавляли 2 мл 95 % метанола, предварительно охлажденного при - 20 ° С, перемешивали встряхиванием на вортексе и выдерживали в темноте в течение 48 ч. Затем образец центрифугировали (центрифуга MiniSpin, «Eppendorf», Германия) в течение 5 мин при комнатной температуре и 14000 об/мин, надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку. После этого 100 мкл надосадочной жидкости смешивали (вортекс V-32, «Biosan», Латвия) с 200 мкл 10 % реактива Фолина-Чокалтеу и оставляли на 3-4 мин. Полученную смесь смешивали (вортекс V-32, «Biosan», Латвия) с 800 мкл 700 мМ раствора Na 2 CО 3 , выдерживали в темноте 2 ч при комнатной температуре и центрифугировали в течение 5 мин при комнатной температуре (14000 об/мин).

Надосадочную жидкость (1 мл) использовали для измерения поглощения при X = 765 нм (A 765 ) на спектрофотометре Eppendorf BioSpectrometer® basic («Eppendorf», Германия). Концентрацию фенольных соединений (С) представляли как мг-экв. галловой кислоты (GAE) на 1 г сырой массы образца. Использовали последовательно две расчетные формулы: X = (A 765 - b)/a, где a и b — коэффициенты из уравнения регрессии калибровочного графика; С = (X V d)/m, где С — содержание фенольных соединений, мг GAE/г сырой массы, V — объем экстрагента (95 % метанол, 2 мл), d — разведение образца (обычно не требуется, тогда 1), m — масса навески образца, мг.

Экспрессию генов анализировали в тех же листовых пробах, которые использовали для определения содержания фенольных соединений.

Целевые гены фенилпропаноидного и флавоноидного путей (группа генов PAL и ген CHS2) выбирали, основываясь на позиции генов в метаболическом пути и транскриптомных данных (Fragments per kilobase of transcript per million mapped fragments; FPKM) базы TomExpress . Экспрессию генов определяли методом количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Последовательности праймеров подбирали, используя сравнительный структурный анализ целевых генов и их мРНК ; с помощью MEGA 7.0 и NCBI-Blast : для генов группы PAL5 5'-cctggtcagattgaggctg-3' и 5'-ccactgtggagatgttcgga-3'; для гена CHS2 5'-ggatgaaatgagaaaggcctca-3' и 5'-tggagcacaacagtctcaac-3'.

Подготовка проб для ПЦР-РВ включала выделение из 0,5 г листовой пробы и очистку суммарной РНК (RNeasy Plant Mini Kit, RNase-free DNase set, «QIAGEN N.V.», Германия), синтез кДНК (GoScript Reverse Transcription System, «Promega», США) и определение их качества (по присутствию полос, соответствующих 18S и 26S рРНК, и соотношению их интенсивности в геле — высокое качество при 26S:18S > 2,0; электрофорез в 1,5 % агарозном геле) и концентрации (Qubit® Fluorometer, «Thermo Fisher Scien-tific», США; Qubit RNA HS Assay Kit, «Invitrogen», США).

Экспрессию целевых генов нормализовали, используя референсные гены Expressed (SGN-U346908) и actin-41 (NM_001330119.1) (25). Для проведения ПЦР-РВ использовали набор «Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I и ROX» (ООО «Синтол», Россия), по 3 нг каждого препарата кДНК, соответствующие праймеры, систему CFX96 Real-Time PCR Detection System («Bio-Rad Laboratories», США). Программа амплификации была следующей: 5 мин при 95 ° С; 15 с при 95 ° С, 40 с при 60 ° С (40 циклов).

Анализы экспрессии генов и содержания фенольных соединений проводили в двух биологических и трех технических повторах. Результаты обрабатывали статистически (GraphPad Prism v. 8, . Данные выражали как средние значения (M) со стандартными отклонениями (±SD). Значимость (p < 0,05) различий между показателями, полученными для разных временных точек, определяли, используя Two-way ANOVA (multiple comparisons, corrected with Bonferroni test).

Результаты . Предполагается, что солеустойчивость растений томата может быть связана, в числе прочего, с активностью генов/ферментов фе-нилпропаноидного (ФАЛ) и флавоноидного (халконсинтаза) пути и содержанием фенольных соединений (23). В нашем опыте по воздействию солевого стресса на взрослые растения четырех сортов томата у двух сортов (Фонарик и VS-342-18) наблюдалось значительное увядание листьев и стебля через 24 ч воздействия стрессора, тогда как два других сорта сохраняли жизнеспособность и демонстрировали визуально слабую реакцию (сорт Гном) или ее отсутствие (сорт Отрадный). Мы предположили, что соле-устойчивость сортов Гном и Отрадный может быть следствием вариабельности генома или унаследованной эпигенетической памяти о солевом стрессе, дающей возможность эффективно приспосабливаться к неблагоприятным условиям.

Несмотря на межсортовые различия, у всех четырех сортов к 24-му ч эксперимента наблюдался существенный рост содержания фенольных соединений в листьях (рис. 1), что подтверждает участие последних в приспособлении растения к повышенным концентрациям NaCl.

Неустойчивые к избытку соли сорта Фонарик и VS-342-18, изначально имевшие сходное количество фенольных соединений в листьях, оказались схожи и по профилю изменения концентрации этих веществ при стрессе (см. рис. 1). В то же время устойчивые сорта Отрадный и Гном показали сходную динамику только в период с 6-го по 24-й ч, а через 1 ч — прямо противоположную, где наиболее устойчивый сорт Отрадный характеризовался активным накоплением фенольных соединений, а сорт Фонарик — снижением их количества (см. рис. 1). Такое различие может быть следствием эпигенетической памяти о стрессе у сорта Отрадный. Поэтому концентрация фенольных соединений спустя 1 ч воздействия солевого стресса может быть использована в качестве биомаркера стрессовой памяти.

На концентрацию фенольных соединений непосредственное влияние оказывает активность генов фенольного метаболизма (26). Проведенный in silico анализ экспрессии генов томата (TomExpress) позволил опре- делить целевые гены для дальнейшего анализа среди известных 16 генов L-фенилаланин-аммоний-лиаз (PAL) и двух генов халконсинтаз (CHS). Как критерий отбора генов использовался наибольший уровень экспрессии в листьях томата, то есть для исследования выбирали гены, которые высоко экспрессировались в листьях; гены с низким уровнем экспрессии в анализ не брали.

Продолжительность солевого стресса, ч

Рис. 1. Содержание фенольных соединений в листьях контрольных (а) и опытных (б) растений томата ( Solanum lycopersicum L.) разных сортов в зависимости от продолжительности солевого стресса: А — Фонарик, Б — VS-342-18, В — Отрадный, Г — Гном ( M ±SD, n = 2, N = 3).

* Различия между контролем и опытом статистически значимы при p < 0,05.

Четыре гена PAL (Solyc09g007890, Solyc09g007900, Solyc09g007910, Solyc09g007920) вошли в целевую группу. Значения FPKM для них составили соответственно 0,7507; 0,7685; 2,757 и 2,6883, что было существенно выше, чем для других 12 генов (0-0,1358 для 11 генов и 0,501 для PAL6, Solyc10g086180) . Все четыре выбранных гена PAL расположены на 9-й хромосоме и высокогомологичны , что предполагает происхождение этих паралогов в результате тандемной дупликации одного из них и, как следствие, сходство их функции и активности. Поэтому праймеры к генам PAL были подобраны таким образом, чтобы анализировать общую экспрессию всех четырех паралогич-ных генов.

Целевая группа генов PAL включала PAL5 (Solyc09g007910) (далее по тексту — группа генов PAL5 ), который известен участием в ответах на различные стрессовые факторы, включая избыток NaCl (27, 28). В группу также вошел PAL3 (Solyc09g007920); ранее показано, что сверхэкспрессия гомологичного ему гена GmPAL1.1 у Arabidopsis thaliana повышает соле-устойчивость прорастающих семян (29). Помимо группы генов PAL5 , для другого гена L-фенилаланин-аммоний-лиаз PAL6 (10-я хромосома) ранее показано повышение экспрессии в ответ на солевой стресс (30, 31). Однако в целевую группу PAL6 не вошел, поскольку его экспрессия в листьях в нормальных условиях была в ∼ 5 раз ниже, чем у PAL5 или PAL3 .

В случае халконсинтаз был выбран ген CHS2 (Solyc05g053550). Хотя оба гена CHS активируются при прайминге семян томата метилжасмона-том (28), содержание транскриптов CHS2 в листе в ∼ 1,4 раза (FPKM

0,1656 vs 0,118) превышает таковой CHS1 (Solyc09g091510) .

Анализ экспрессии целевых генов методом ПЦР-РВ показал, что каждый из четырех сортов томата характеризовался индивидуальной динамикой ответа на солевой стресс (рис. 2).

Рис. 2. Дифференциальная экспрессия группы генов PAL5 и гена CHS2 в листьях у сортов томата ( Solanum lycopersicum L.) в зависимости от продолжительности солевого стресса: А — Фонарик, Б — VS-342-18, В — Отрадный, Г — Гном; а — контроль, б — опыт ( M ±SD, n = 2, N = 3).

* Различия между контролем и опытом статистически значимы при p < 0,05.

Только у сорта VS-342-18 экспрессия PAL5 сильно выросла через 1 ч после переноса растений в раствор, содержащий NaCl, и опустилась почти до значений контроля через 6 ч (см. рис. 2), как это было показано для образца томата с неизвестной чувствительностью к избытку соли в исследовании J. Guo с соавт. (27). Неустойчивые сорта Фонарик и VS-342-18

показали схожий профиль экспрессии генов группы PAL5 в период 6-24 ч, а через 1 ч после начала воздействия стресса — прямо противоположный: снижение экспрессии (Фонарик) или ее повышение (VS-342-18) (см. рис. 2).

Устойчивые сорта Отрадный и Гном также имели различия в стрессовой реакции генов группы PAL5 : наблюдалась контрастная динамика через 1 и 24 ч и сходная через 6 ч. Однако к 6-му ч содержание транскриптов PAL5 у сорта Отрадный оказалось почти в 3 раза ниже, чем у сорта Гном, и за счет разнонаправленной динамики к 24-му ч экспрессия PAL5 у этих сортов почти сравнялась. Единственное отличие сорта Отрадный, предположительно имеющего стрессовую память, от других сортов — снижение активности PAL5 через 24 ч (см. рис. 2).

В случае CHS2 неустойчивые сорта Фонарик и VS-342-18 показали прямо противоположную динамику экспрессии гена, тогда как устойчивые сорта Отрадный и Гном имели сходную реакцию (см. рис. 2). При этом профиль CHS2 был противоположен профилю генов PAL5 у сортов, за исключением сорта VS-342-18, у которого динамика экспрессии CHS2 и PAL5 совпадала (см. рис. 2). Каких-либо специфических особенностей экспрессии CHS2 у сорта Отрадный не наблюдалось.

Повышенное накопление фенольных соединений к 24-му ч стрессового воздействия у всех сортов (см. рис. 1) никак не коррелировало с профилем экспрессии генов PAL5 и CHS2 (см. рис. 2), что предполагает гено-тип-специфичную регуляцию биосинтеза фенольных соединений при ответе на стрессор. Следовательно, с учетом полученных нами данных в сочетании с разной солеустойчивостью анализируемых сортов профиль экспрессии CHS2 не подходит для оценки степени проявления признака, тогда как снижение экспрессии генов группы PAL5 через 24 ч (см. рис. 2) может быть использовано как биомаркер памяти.

В пользу последнего свидетельствует участие генов группы PAL5 в ответе на осмотические (включая засоление) и биотические стрессоры (27, 28) и повышение солеустойчивости растения при сверхэкспрессии генов группы PAL5 (29).

В частности, J. Guo с соавт. (27) продемонстрировали присутствие в геноме томата семейства генов SlPAL5 и их сильную экспрессию в молодых и зрелых листьях (27), что соответствовало нашему выбору целевых генов группы PAL5 . Авторы показали, что экспрессия SlPAL5 стимулируется не только воздействием NaCl, но и другими видами стресса (засуха, симулированная маннитолом, и холод) (27). В отличие от наших данных, резкий рост экспрессии гена в ответ на засоление происходил спустя 1 ч после начала воздействия и далее постепенно снижался к 24 ч (27). В нашем исследовании экспрессия SlPAL5 резко выросла к 1-му ч стресса только у солечувствительного сорта VS-342-18 и в целом оказалась генотип-специфич-ной, снизившись к 24-му ч только у сорта Отрадный (см. рис. 2). Подобный контраст может объясняться, во-первых, тем, что авторы (27) использовали вдвое большую концентрацию соли (200 мМ), чем в нашей работе (100 мМ), и ответ растения ожидаемо должен быть более быстрым и выраженным. Во-вторых, в статье J. Guo с соавт. (27) отсутствуют данные о солеустойчивости использованного сорта томата. Тем не менее эти результаты подкрепляют наше предположение о возможном статусе генов группы PAL5 как биомаркера стрессовой памяти.

Еще одним подтверждением статуса генов PAL5 как биомаркеров стало исследование P. Kr o l с соавт. (28), где было продемонстрировано повышение экспрессии PAL5 в ответ на прайминг метилжасмонатом, использованный в целях защиты рассады томата от фузариозного увядания (28). 28

Авторы показали, что такой прайминг повышает устойчивость рассады к грибам Fusarium , и в ответ на инфекцию патогеном в листьях рассады значительно увеличивается содержание фенольных соединений и экспрессия PAL5 (28). Следовательно, гены группы PAL5 участвуют в защитном ответе растений томата не только на абиотические, но и на биотические стрессоры.

Наконец, важным свидетельством ключевой роли генов группы PAL5 в стрессовом ответе растений и, как следствие, в запоминании стресса стало получение и анализ растений Arabidopsis со сверхэкспрессией гена GmPAL1.1 сои ( Glycine max ) (29), продукт которого высокогомологичен белкам томата группы PAL5. Такие трансгенные растения накапливали повышенное количество флавоноидов в листьях, и их семена обладали повышенной устойчивостью к засолению и засухе при прорастании (29).

С учетом имеющихся данных (27-29) выдвинутое нами предположение о генах группы PAL5 как биомаркерах стрессовой памяти требует дополнительных экспериментов по оценке экспрессии этих генов с имитацией повторяющихся (многоцикловых) воздействий солевого стресса и с варьированием условий воздействия (например, продолжительности обработки или концентрации NaCl).

Таким образом, в настоящем исследовании был определен профиль изменения содержания фенольных соединений и экспрессии ключевых генов фенилпропаноидного и флавоноидного пути (группы генов PAL5 и гена CHS2 ) в процессе воздействия избытка NaCl на растения сортов томата Отрадный, Гном, Фонарик и VS-342-18. Подтверждены данные Федерального научного центра овощеводства (ФНЦО) о солеустойчивости сортов Отрадный (наиболее устойчив) и Гном (менее устойчив), а также о чувствительности к засолению сортов Фонарик и VS-342-18. Наибольшей устойчивости сорта Отрадный сопутствовало активное (в ∼ 2 раза) повышение содержание фенольных соединений в начале стрессового воздействия (1 ч), тогда как три других сорта характеризовались снижением (Фонарик, Гном) или отсутствием изменений (VS-342-18) количества фенолов. При этом к 24-му ч стресса все четыре сорта демонстрировали существенный рост содержания фенольных соединений (в ∼ 1,4-4,7 раза). Определены целевые (для анализа экспрессии в динамике стрессового воздействия) гены фенилпропаноид-ного (четыре гена PAL Solyc09g007890, Solyc09g007900, Solyc09g007910 — PAL5 , Solyc09g007920 — PAL3 ) и флавоноидного (ген CHS2 ) путей с наибольшей экспрессией в листьях томата (согласно in silico данным). Каждый из четырех сортов томата характеризовался индивидуальной динамикой экспрессии целевых генов в ответ на засоление. Наиболее устойчивый сорт Отрадный отличался от трех других сортов снижением экспрессии генов группы PAL5 в конце стрессового воздействия (24 ч), тогда как в случае гена CHS2 специфики не обнаружено. На основе результатов исследования выдвинуто предположение, что в качестве биомаркеров наличия у растений томата стрессовой памяти могут использоваться концентрация фенольных соединений спустя 1 ч воздействия солевого стресса и снижение экс-прессионной активности генов PAL5 спустя 24 ч воздействия. Полученные данные могут быть применены в селекции солеустойчивых сортов томата.