Связь содержания белка DLK-1 в сыворотке крови с выживаемостью больных с глиобластомами

Глиобластома (ГБ) является наиболее часто встречающейся первичной опухолью головного мозга высокой степени злокачественности с быстрым ростом и фатальным прогнозом. Общая 1-летняя выживаемость составляет около 40 %, а 5-летняя – варьирует от 0,05 до 6,9 % [1, 2]. Стандартом лечения ГБ является комбинированная терапия, включающая нейрохирургическое вмешательство, адъювантную химиолучевую терапию (ХЛТ) с последующими курсами адъювантной химиотерапии темозоломидом [3–5]. Прогноз заболевания зависит от нескольких факторов, включающих степень резекции опухоли, возраст и функциональный статус пациентов. При наличии в опухоли метилирования промотора MGMT (фермент репарации ДНК О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы) пациенты имеют более высокие показатели выживаемости вследствие большей чувствительности к терапии [6]. Рецидив опухоли является основной причиной смерти пациентов с глиобластомой [7].

Для наблюдения за пациентами и оценки ответа на лечение рекомендуется МРТ головного мозга с использованием стандартных протоколов в соответствии с критериями ответа в нейроонкологии (RANO, Response Assessment in Neuro-Oncology) [8]. Накопление контрастного вещества в зоне облучения головного мозга в сроки до 1 года после проведения лучевой терапии может свидетельствовать не только о возникновении рецидива, но и о постлучевых изменениях головного мозга – феномене «псевдопрогрессии». Общая чувствительность и специфичность стандартной МР-визуализации в оценке ответа на лечение злокачественных глиом не превышает 80 % [9]. Неоднозначные результаты контрольных исследований определяют необходимость поиска биомаркеров для диагностики рецидива заболевания, а также определения прогноза лечения.

Злокачественные новообразования выбрасывают в кровоток и другие физиологические жидкости опухолевое содержимое в виде циркулирующих опухолевых клеток, внеклеточных везикул, свободных внеклеточных нуклеиновых кислот и белков. В настоящее время не идентифицированы белки, являющиеся специфичными для ГБ, поэтому поиск белковых маркеров при этой патологии фокусируется на отклонениях в уровнях нормальных физиологически секретируемых белков, при которых можно надежно диагностировать ГБ и определить прогноз пациента.

Дельта-подобный неканонический лиганд Notch 1 (DLK-1) представляет собой трансмембранный и секретируемый белок в семействе лигандов Notch, способный передавать сигналы Notch-зависимым и независимым образом. Характерными свойствами этого протеина являются активация Notch пути, активация пролиферации во время нейрогенеза в эмбриональный период, а также стимуляция неоангиогенеза [10, 11]. Регуляция экспрессии DLK-1 плохо изучена, однако в экспериментальных исследованиях было показано, что экспрессия DLK-1 повышается в глиомах с увеличением степени злокачественности и агрессивных характеристик опухоли, а также может свидетельствовать о прогрессировании глиобластомы [12, 13]. Определение содержания белка DLK-1 может иметь существенное значение для повышения эффективности диагностики прогрессирования у пациентов с опухолями головного мозга на этапах комбинированного лечения и оценки прогноза пациентов.

Цель исследования заключалась в изучении диагностического и прогностического значения содержания секретируемого DLK-1 в сыворотке крови у пациентов с глиобластомами головного мозга на этапах комбинированного лечения.

Материал и методы

В исследование включено 39 пациентов с впервые диагностированной глиобластомой головного мозга, получавших лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ. Возраст больных варьировал от 19 до 70 лет, медиана составила 55 лет (95 % ДИ 47–61 год). На первом этапе комбинированного лечения всем пациентам выполнялось оперативное вмешательство в условиях нейрохирургических стационаров. Диагноз глиобластомы IDH-wildtype, WHO Grade 4, был установлен при пересмотре микропрепаратов с выполнением иммуногистохимических и молекулярно-генетического исследований в условиях лабораторий НИИ онкологии в соответствии с патоморфологической классификацией ВОЗ опухолей ЦНС 2021 г. [14]. Статус метилирования гена MGMT в опухоли был оценен у 32 пациентов. Исследование выполнялось с использованием ко- личественной метил-специфичной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени из материала парафиновых блоков. Метилирование промотора гена MGMT было диагностировано у 10 пациентов, у 22 пациентов промотор MGMT метилирован не был.

В плане комбинированного лечения все пациенты с ГБ получили курс ХЛТ в режиме стандартного фракционирования дозы 2 Гр 5 дней в неделю до СОД 60 Гр с радиосенсибилизацией темозоломидом 75 мг/м2 внутрь ежедневно. Через 4 нед после завершения ХЛТ проводилась оценка результатов лечения. В дальнейшем пациенты получали адъювантную химиотерапию по схеме: Темозоломид 150–200 мг/м2 в 1–5-й дни; цикл 28 дней, с оценкой результатов лечения после каждых 2 курсов химиотерапии. Контрольное обследование включало осмотр невролога, МРТ головного мозга с контрастированием, оценку содержания секретируемого DLK-1 в сыворотке крови. Диагностика прогрессирования процесса осуществлялась на основании критериев RANO-HGG (Response Assessment in Neuro-Oncology criteria for high-grade gliomas) [8].

Содержание секретируемого DLK-1 оценивалось в сыворотке крови и ликворе пациентов. Забор образцов сыворотки и ликвора выполнялся перед началом лучевой терапии (в сроки 4–6 нед после оперативного лечения). Затем образцы сыворотки отбирали при оценке результатов ХЛТ и после каждых 2 курсов адъювантной химиотерапии. Определение содержания секретируемого DLK-1 в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости выполнялось с использованием анализатора иммуноферментных реакций АИФР-01 Униплан и наборов иммуноферментного анализа (Cloud clone corporation, США), результаты выражали в нг/мл.

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ Statistica 10.0. Проверка нормальности распределения выполнялась с использованием критерия Шапиро–Уилка. Значимость различий независимых параметров в группах при ненормальном распределении оценивалась посредством дисперсионного анализа с использованием Н-критерия Краскела–Уоллеса. Различия считали значимыми при р<0,05. Для оценки выживаемости использовался моментный метод Каплана-Мейера с построением кривых выживаемости.

Результаты

В результате проведенного исследования выявлено, что медиана уровня белка DLK-1 в парных образцах у пациентов до начала химиолучевой терапии в ликворе составила 1,17 нг/мл (95 % ДИ 0,78; 2,89), а в сыворотке крови – 0,27 нг/мл (95 % ДИ 0,26; 0,29), различия были статистически значимы (р=0,006). Учитывая вероятность осложнений после выполнения люмбальной пункции и невозможность серийного повторного взятия образцов ликвора, на этапах комбинированного лечения и динамического наблюдения определение белка DLK-1 на дальнейших этапах комбинированного лечения выполнялось в сыворотке крови. На этапах комбинированного лечения не было обнаружено статистически значимых различий в содержании белка DLK-1 у пациентов с различным ответом на терапию, отмечался широкий размах значений при любой активности онкологического процесса. Наибольшая медиана содержания исследуемого маркера отмечалась при выявлении феномена «псевдопрогрессии», а самая низкая – при стабилизации процесса, р=0,2 (рис. 1).

Было оценено предиктивное влияние уровня DLK-1 в сыворотке пациентов с глиобластомой на результаты ХЛТ. Мы разделили пациентов на группу с контролем опухолевого роста (стабилизация и полная регрессия) и группу с прогрессированием процесса после проведения ХЛТ. Медиана уровня исследуемого белка в сыворотке до начала ХЛТ у пациентов с прогрессированием процесса составила 0,43 нг/мл (95 % ДИ 0,28–1,41), а при контроле опухолевого роста – 1,7 нг/мл (95 % ДИ 1,32–2,02), различия были статистически значимы (р=0,012).

При оценке результатов адъювантной химиотерапии у пациентов с контролем опухолевого роста и прогрессированием процесса не обнаружено предиктивного влияния DLK-1 в сыворотке крови. Медиана содержания исследуемого маркера перед началом адъювантной химиотерапии (через 4 нед после ХЛТ) у пациентов с контролем роста составила 1,6 нг/мл (95 % ДИ 1,32–1,71), а у пациентов с прогрессированием – 0,72 нг/мл (95 % ДИ 0,28– 1,95), различия не были значимыми (р=0,27).

У пациентов с метилированным промотором MGMT в опухоли медиана содержания исследуемого маркера в сыворотке до ХЛТ составила 1,32 нг/мл (95 % ДИ 0,28–1,6), а при отсутствии метилирования промотора MGMT – 0,33 нг/мл (95 % ДИ 0,21–1,19), различия не были значимыми (р=0,07). После ХЛТ уровень DLK-1 у пациентов с метилированным промотором MGMT составил 1,28 нг/мл (ДИ 95 % 0,27–1,61), при отсутствии метилирования промотора MGMT – 1,71 нг/мл (ДИ 95 % 1,43–1,81), различия также не были значимыми (р=0,27).

В исследовании прослежены исходы течения заболевания у 36 пациентов, 3 пациента выбыли из-под наблюдения из-за смены места жительства. Рецидив/продолженный рост опухоли диагностирован у 30 пациентов в сроки от 2 до 34 мес, медиана безрецидивной выживаемости – 7,0 мес (95 % ДИ 4,0–17,3 мес). Без признаков рецидива наблюдаются 6 пациентов в сроки от 18 до 73 мес. Специализированное лечение после прогрессирования продолжают получать 12 больных. Летальный исход зарегистрирован в 19 случаях. Медиана общей выживаемости в исследовании

Рис. 1. Содержание DLK-1 в сыворотке крови у больных ГБ в зависимости от ответа на комбинированное лечение. Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 1. The DLK-1 serum level in patients with glioblastoma depending on the treatment response.

Note: created by the authors составила 23,5 мес (95 % ДИ 13,0–52,1 мес). При оценке нормальности распределения сроков выживаемости пациентов обнаружено, что подавляющее большинство случаев рецидивов возникает в сроки до 10 мес, а летальных исходов – в сроки до 20 мес (рис. 2). Эти сроки мы приняли как критерии благоприятного и неблагоприятного прогноза.

При оценке взаимосвязи между уровнем DLK-1 в сыворотке пациентов с глиобластомой до начала ХЛТ и сроком первого рецидива обнаружено, что уровень маркера у пациентов с благоприятным прогнозом безрецидивной выживаемости составил 1,60 нг/мл (95 % ДИ 1,32–1,71), а у пациентов с неблагоприятным прогнозом – 0,32 нг/мл (95 % ДИ 0,23–0,43), различия значимые (р=0,005). Значимого влияния уровня DLK-1 после адъювантной ХЛТ на сроки первого рецидива не получено. Уровень DLK-1 через 4 нед после адъювантной ХЛТ у пациентов с благоприятным прогнозом безреци-дивной выживаемости составил 1,53 нг/мл (95 % ДИ 0,24–1,91), а при неблагоприятном прогнозе – 0,51 нг/мл (95 % ДИ 0,23–1,81), р=0,55 (рис. 3).

Медиана концентрации DLK-1 в сыворотке до начала ХЛТ у пациентов с благоприятным прогнозом общей выживаемости составила 1,01 нг/мл (95 % ДИ 0,38–1,71), у больных с неблагоприятным прогнозом – 0,32 нг/мл (95 % ДИ 0,28–1,32), различия значимые (р=0,04). Уровень DLK-1 через 4 нед после ХЛТ у пациентов с благоприятным прогнозом общей выживаемости составил 1,53 нг/мл (95 % ДИ 0,39–1,86), при неблагоприятном прогнозе – 0,23 нг/мл (95 % ДИ 0,23–1,28), различия также были значимые (р=0,04).

Обсуждение

Глиобластома является наиболее часто диагностируемой и агрессивной первичной злокачествен-

Рис. 2. Распределение сроков безрецидивной (а) и общей выживаемости (б) пациентов с глиобластомой.

Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 2. Time distribution of relapse-free (a) and overall survival (b) in patients with glioblastoma. Note: created by the authors

Рис. 3. Уровень DLK-1 в сыворотке крови больных с глиобластомой с неблагоприятным и благоприятным прогнозом безрецидивной выживаемости до начала химиолучевой терапии (а) и после химиолучевой терапии (б). Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 3. The DLK-1 serum level in glioblastoma patients with favorable and unfavorable prognosis of progression-free survival before starting chemoradiotherapy (a) and after chemoradiotherapy (b). Note: created by the authors

Рис. 4. Уровень DLK-1 в сыворотке крови больных с глиобластомой с неблагоприятным и благоприятным прогнозом общей выживаемости до начала химиолучевой терапии (а) и после химиолучевой терапии (б).

Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 4. The DLK-1 serum level in patients with glioblastoma with unfavorable and favorable prognosis of overall survival before starting chemoradiotherapy (a) and after chemoradiotherapy (b). Note: created by the authors ной опухолью головного мозга. Своевременное мультидисциплинарное лечение рецидива глиобластомы позволяет увеличить общую выживаемость пациентов, сохранить качество жизни и независимость от постороннего ухода. В течение 12 мес после лучевой терапии появление новых или увеличение существующих ранее очагов накопления контрастного вещества на МРТ в зоне облучения головного мозга может свидетельствовать не только о возникновении рецидива опухоли, но и о постлучевых изменениях головного мозга – феномене «псевдопрогрессии». Псевдопрогрессия обычно возникает в течение 12 нед после лучевой терапии у 10–30 % пациентов с глиобластомой и затем спонтанно регрессирует или стабилизируется без каких-либо изменений противоопухолевого лечения [15]. Этот феномен более распространен при наличии метилированного промотора MGMT в опухоли и свидетельствует об эффективности проводимой терапии и благоприятном прогнозе [16]. Неправильная оценка псевдопрогрессии может привести к преждевременной отмене эффективной терапии или, при недооценке прогрессирования процесса, – к нарастанию неврологического дефицита и ухудшению результатов лечения. Верификация рецидива ГБ с помощью биопсии не проводится вследствие высокоинвазивного характера процедуры и наличия осложнений, которые могут ухудшить состояние пациента. В настоящее время идет активный поиск биомаркеров, которые позволили бы надежно диагностировать глиобластому до оперативного вмешательства, определить ее прогноз и ответ на лечение [17].

Дельта-подобный неканонический лиганд Notch 1 обладает трансмембранной и секретируемой изоформой, определение которой в сыворотке крови происходит при поражении ЦНС и нарушении гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Соотношение между изоформами этого биомаркера является фундаментальным для поддержания нейрональных стволовых клеток в зародышевой нише субвентрикулярной зоны с раннего постнатального периода и на протяжении всей взрослой жизни. Специализированные нишевые астроциты секретируют DLK-1, в то время как нервные стволовые клетки экспрессируют только изоформу, связанную с мембраной. Секретируемый DLK1 действует как нишевый паракринный фактор и посредством мембраносвязанной формы, экспрессируемой нервными стволовыми клетками, регулирует их количество независимым от Jag1 и Notch1 образом. Прекращение экспрессии DLK-1 либо в астроцитах, либо в нервных стволовых клетках приводит к дифференцировке в зрелые нейроны и потере пула стволовых клеток [12, 18].

DLK-1 можно обнаружить не только в цереброспинальной жидкости, но и в образцах сыворотки и плазмы человека. У здоровых людей содержание этого маркера обычно низкое и практически не поддается обнаружению. DLK-1 экспрессируется с высокой частотой при многих распространенных злокачественных новообразованиях (печень, молочная железа, головной мозг, поджелудочная железа, толстая кишка и легкие). Хотя точный механизм, посредством которого функционирует DLK-1, до конца не изучен, известно, что он поддерживает клетки в недифференцированном фенотипе и обладает онкогенными свойствами [10].

В результате проведенного исследования обнаружено, что уровень белка DLK-1 в ликворе у пациентов был значимо выше, чем в сыворотке крови в парных образцах. Полученные результаты более вероятно обусловлены нарушением ГЭБ у пациентов с ГБ и отсутствием активного транспорта исследуемого маркера через ГЭБ.

В экспериментальных исследованиях обнаружено, что экспрессия белка DLK-1 в глиомах выше, чем в нормальном мозге [13, 20]. Среда, обогащенная секретируемым DLK-1, способствовала росту глиомы [19, 21], а введение антитела к DLK-1 блокировало рост клеток, стимулированный DLK-1 [21]. На основании этих данных нами предположена возможность обнаружения прогрессирования глиобластомы при помощи оценки концентрации DLK-1 в сыворотке крови пациентов. Полученные в нашем исследовании результаты не показали значимых различий DLK-1 в сыворотке пациентов с ГБ при стабилизации процесса, прогрессировании, при псевдопрогрессии и полном ответе на терапию. Ранее исследователями показаны противоречивые результаты влияния DLK-1 на онкологический процесс в зависимости от гистологической структуры опухоли. Предположено, что функциональная роль DLK-1 и соотношение его изоформ могут отличаться в разных типах тканей и по-разному влиять на конечный результат [10, 11].

При оценке содержания DLK-1 у пациентов после хирургического лечения ГБ до начала ХЛТ обнаружены значимые различия уровня исследуемого белка в сыворотке в зависимости от непосредственных результатов химиолучевого лечения. Для пациентов с отсутствием чувствительности к ХЛТ с темозоломидом (прогрессирование процесса после ХЛТ) был характерен более низкий уровень DLK-1 в сыворотке крови, по сравнению с больными, у которых диагностирован контроль роста после лучевой терапии. Ранее в клинических исследованиях не проводилась оценка предиктивного влияния уровня дельта-подобного неканонического лиганда Notch 1 на результаты комбинированного лечения глиом. В модельных исследованиях, несмотря на более инвазивный характер глиомы при повышенной экспрессии DLK-1, снижения выживаемости мышей с глиомой обнаружено не было [13].

Оценка прогностического влияния уровня секретируемого DLK-1 у пациентов на безрецидивную и общую выживаемость показала, что у пациентов с высоким уровнем общей и безрецидивной выживаемости содержание DLK-1 в сыворотке перед началом ХЛТ было статистически значимо выше, чем у пациентов с низким уровнем выживаемости. А через 4 нед после завершения ХЛТ (при оценке результатов лечения) уровень DLK-1 был значимо выше у пациентов с высоким уровнем общей выживаемости, но не имел прогностического значения в отношении безрецидивной выживаемости. В выполненных ранее клинических исследованиях оценено прогностическое влияние экспрессии DLK-1 только в опухолевых образцах. В ряде исследований обнаружено, что экспрессия DLK-1 в опухолевых образцах коррелирует с низкой общей выживаемостью у пациентов с раком печени [20], низкой безре-цидивной выживаемостью при немелкоклеточном раке легких [22], низкой общей и безрецидивной выживаемостью у пациентов с гастроинтестинальными опухолями [23] и серозной карциномой яичников высокой степени злокачественности [24]. Адъювантная терапия ассоциировалась с лучшим исходом у пациентов с DLK1-негативными по сравнению с DLK1-позитивным гастроинтестинальными опухолями [23].

Полученные в нашем исследовании результаты согласуются с противоречивыми результатами влияния DLK-1 на онкологический процесс, показанными ранее. Для определения значения этого биомаркера у пациентов с глиомами необходимы дальнейшие исследования с определением различных изоформ DLK-1 на более репрезентативных группах пациентов с глиомами различной степени злокачественности.