Связь способности эритроцитов к деформации со структурными перестройками мембран красных клеток крови у лиц различных возрастных групп

Введение. Одним из важнейших свойств эритроцита является его способность к деформируемости. Главное значение для деформируемости эритроцитов имеют вязкостноэластичные свойства мембраны, которые определяются, прежде всего, состоянием спектри-но-актинового комплекса и его взаимодействием с другими структурными элементами мембраны, в частности, с липидным бислоем [1]. Деформируемость эритроцитов претерпевает значительные изменения с возрастом. В процессе старения эритроцитов происходит снижение функционального уровня реологических свойств красных клеток крови [2-3]. Это может быть связано с морфофункциональными изменениями в строении их мембран.

Цель исследования: определить основные изменения в состоянии и структуре липидной и белковой компонент мембран эритроцитов в разных возрастных группах, влияющих на деформируемость мембран эритроцитов.

Материал и методы исследования. Были обследованы практически здоровые люди (n=111) в возрасте от 20 до 59 лет, из них – 45 женщин и 66 мужчин. Для изучения возрастных особенностей эритроцитов все обследуемые люди были разбиты на четыре группы: от 20-29 лет; от 30-39 лет; от 40-49 лет; от 50-59 лет. Эритроциты получали из крови обследуемых людей путем пункции локтевой вены.

Определения микровязкости мембран по флюоресценции зонда пирена проводили по методу Г.Е.Добрецова [4], причем мономеры и эксимеры имеют четко различимые спектры флюоресценции с максимумом соответственно 390 и 480 нм. Индекс микровязкости мембран определяли как отношение флюоресценции пирена при 480 и 390 нм. Осмотическую резистентность эритроцитов определяли с помощью модифицированного метода В.К.Петрова [5] с применением антибиотика амфотерицина Б (АМТБ), основанного на его специфическом каналообразующем воздействии на липидную часть мембраны эритроцитов.

Для проведения исследований белков мембраны эритроцитов их трижды отмывали 0,9 % раствором хлорида натрия, затем гемолизировали, отмывку теней проводили по методу

I.Tannert [6]. Термообработку белкового препарата (в течение 5 минут) и электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na) проводили в ступенчатом градиенте плотности геля от 13,5 до 5 % в течение 5,5 часов. Гели окрашивали Кумасси G 250 бриллиантовым голубым, вымачивая в растворе красителя-фиксатора, содержащего 45 % метанола и 25 % уксусной кислоты в течение 12 часов, дифференцировали 10 % уксусной кислотой и денситометрировали. Количественную оценку содержания отдельных белковых фракций проводили методом взвешивания пиков.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica for Windows 6.0 . Достоверность различий средних величин оценивали при уровне значимости p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Сложность строения эритроцитов обусловливает зависимость их деформируемости от вязкости внутреннего содержимого и структурно-функционального состояния мембраны, причем, деформируемость клетки в большей степени связана с конформантными перестройками липидного бислоя. Об увеличении его вязкости в мембранах эритроцитов судили по изменению индекса микровязкости (табл.1), определяемому с помощью липотропного зонда пирена.

Таблица 1

Значение индекса микровязкости мембран эритроцитов у пациентов разных возрастных групп

Показатель	I группа, n=31	II группа, n=29	III группа, n=28	IV группа, n=23
Индекс микровязкости мембран эритроцитов	0,88 ± 0,02	0,84 ± 0,03*	0,62 ± 0,01*	0,52 ± 0,02*

*p<0,001 по сравнению cо следующей группой

Было зарегистрировано достоверное (p<0,001) уменьшение индекса микровязкости мембран эритроцитов, коррелирующее с возрастом пациентов в ряду I-II-III-IV группы. Обращает на себя внимание и тот факт, что статистически значимое снижение микровязкости липидов мембран эритроцитов происходит именно после 40 лет – на 35,5 %, после 50 лет это снижение не превышает 19,2 %. В качестве дополнительного критерия состояния липидного бислоя учитывалась степень гипотонического гемолиза эритроцитов в присутствии антибиотика АМТБ, обладающего специфическим каналообразующим воздействием на липидную часть мембраны.

Установлено, что все три используемые концентрации (0,006 %; 0,008 %; 0,01 %) АМТБ вызывали достоверно (p < 0,001) большую степень гемолиза в пробах эритроцитов у практически здоровых людей старших возрастных групп по сравнению с показателями пациентов I группы (табл.2).

Между чувствительностью эритроцитов обследованных групп к АМТБ и индексом микровязкости имеется отрицательная корреляционная связь (r=-0,94), то есть чем больше возрастает микровязкость их липидного бислоя, тем ниже их осмотическая резистентность. Это явление вполне закономерно, так как «жесткий» эритроцит менее эластичен и при проникновении в него жидкости из гипотонической среды (через образуемые АМТБ «каналы») разрушается быстрее, чем обычный.

Таблица 2

Осмотическая резистентность эритроцитов в присутствии АМТБ у пациентов разных групп

Группы наблюдения	Количество гемолизированных эритроцитов в присутствии разных концентраций АМТБ, %
	0,006	0,008	0,01
I группа, n=31	13,5 ± 0,1	16,9 ± 0,2	21,9 ± 0,2
II группа, n=29	14,8 ± 0,2	24,3 ± 0,1	34,3 ± 0,2
III группа, n=28	28,4 ± 0,2	49,9 ± 0,3	76,3 ± 0,6
IV группа, n=23	38,9 ± 0,4*	62,2 ± 0,7*	97,4 ± 0,6*

*p<0,001 по сравнению с I-ой группой

Кроме того, как показал индекс микровязкости, у пациентов старших возрастных групп имеются изменения в структуре липидного бислоя (при старении изменяется липидный состав поверхностных мембран форменных элементов крови в пользу преобладания в мембране холестерина [7]), которые приводят, по-видимому, к образованию в эритроцитах у пациентов старших возрастных групп большего количества «каналов», чем в клетках лиц из групп «контроля» (I,II-я группы).

Поскольку деформируемость клеток контролируется мембранным белком спектрином, то логично предположить, что за уменьшение коэффициента деформируемости ответственны изменения количественного содержание и (или) изменения структуры взаимосвязи спектрина в процессе жизнедеятельности клетки. Для подтверждения этого предположения нами были изучены характеристики белковой части мембран эритроцитов пациентов всех групп наблюдения.

Количественные изменения в белках эритроцитов у пациентов разных групп приведены в табл.3.

Таблица 3

Содержание белков в мембранах эритроцитов

Группы наблюдения	Обозначения фракций белков	Содержание фракций белков в мембранах Э, %
I группа, n=31	1	4,26 ± 0,1
	2	2,75 ± 0,2
	3	2,89 ± 0,2
	4	4,36 ± 0,2
	5	8,45 ± 0,2
	6-10	17,98±0,4
	11	8,76 ±0,4

Продолжение табл.3

	12	23,57±0,6
	13	24,61±0,5
II группа, n=29	1	4,11± 0,3
	2	2,56±0,2
	3	2,87±0,1
	4	3,81±0,2
	5	8,43±0,3
	6-10	17,52±0,4
	11	8,65±0,2
	12	24,54±0,4
	13	25,35±0,4
III группа, n=28	1	2,32±0,1*
	2	2,37±0,2
	3	2,29±0,2
	4	2,75±0,5
	5	8,36±0,6
	6-10	16,21±0,5
	11	8,41±0,4
	12	23,62±0,2
	13	29,65±0,8*
IV группа, n=23	1	1,32±0,3*
	2	2,17±0,1
	3	2,18±0,5
	4	2,37±0,2*
	5	6,34±0,6**
	6-10	16,11±0,4
	11	8,23±0,2
	12	23,58±0,4
	13	38,13±0,6**

*p<0,05 ,**p<0,001 по сравнению с группой контроля

Как видно из этой таблицы, относительное содержание высокомолекулярных скелетных белков спектринов (фракция 13) в первых двух группах статистически не отличается друг от друга. Спектрин является важным компонентом белковой сети (цитоскелета), поддерживающей структурную целостность и двояковогнутую форму эритроцитов. Именно цитоскелет, в основу которого входит спектрин, позволяет эритроцитам противостоять давлению на мембрану при прохождении через капилляры [8]. В то же время его избыток может привести к повышению ригидности клетки и нарушению деформируемости эритроцитов.

Повышение содержания - на 16,9 %(р<0,05) по сравнению с пациентами II-ой группы отмечено у лиц старше 40 лет, у пациентов старше 50 лет по сравнению с лицами первой и второй групп это увеличение составляет уже 50,4 % (р<0,001). Поскольку значительный удельный рост спектрина в мембране клеток приходится на возраст старше 50 лет, невозможно связать резкое увеличение жесткости мембран у лиц старше 40 лет с его увеличением.

Согласно современной классификации, белки с молекулярным весом 35 кД (4 фракция) включают в себя глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, важнейший фермент энергетического обмена эритроцита, локализованный на внутренней стороне мембраны. Содержание белка этой полосы достоверно (р<0,001) снижается в мембранах эритроцитов в направлении от I к IV группе, что может приводить к нарушениям энергетического обмена эритроцитов.

У всех пациентов старших возрастных групп нами зарегистрировано также уменьшение содержания глутатион-S-трансферазы (фракция 1). Динамика количественного снижения фермента (в ряду I-II-III-IV групп) аналогична динамике снижения 4 фракции. Возможно, что снижение ее активности сопряжено с увеличением активности процессов перекисного окисления липидов и изменением качественного состояния липидов мембран эритроцитов. Косвенным подтверждением этого является изменение динамики перекисного гемолиза в присутствии амфотеррицина В.

Содержание полосы с молекулярным весом 43 кД (фракция 5), идентифицируемых как актин, достоверно снижено (p < 0,05) только у больных из IV группы.

Одновременное снижение содержания фактически всех белковых фракций с относительно низким молекулярным весом и локализованных на внутренней стороне мембраны эритроцитов отчасти может быть объяснено структурно-функциональными изменениями мембран эритроцитов с возрастом. Представляется вероятным, что нарушение структурной организации мембран ведет к ослаблению связей ряда белков с мембраной и более интенсивному их протеолизу и вымыванию из последней.

Выводы. Таким образом, снижение функционального уровня реологических свойств клеток в процессе их старения выражается в увеличении вязкости мембран клеток, ослаблении их антиоксидантных свойств и энергообмена, снижении их осмотической стойкости на фоне увеличения в структуре мембран количества белков цитоскелета и нарушения белково-липидных взаимодействий их мембран.