Связывающая способность кортикостероидсвязывающего глобулина плазмы крови как механизм повышения свободной фракции гормона в патогенезе острой лучевой болезни
Бесплатный доступ
Исследование гормонального уровня организма в патогенезе острой лучевой болезни не теряет своей актуальности в связи с расширением перечня источников радиационной опасности. Значение результатов работы заключается в необходимости уточнения ряда положений радиобиологии о роли связывающей способности кортикостероидсвязывающего глобулина плазмы крови в повышении свободной фракции гормона в динамике острой лучевой болезни. Определение роли свободных кортикоидов в гормональном эффекте при острой лучевой болезни у животных с моно- и с двухфазной кривой адренокортикальной реакции на облучение было целью работы. Эксперименты проведены на кроликах-самцах и белых беспородных крысах. Животные получили дозу g-облучения, вызывающую острую лучевую болезнь IV стадии. Общее содержание 11-оксикортикостероидов (11-ОКС, мкг%) определяли флюориметрическим методом Guillemin et al. [1] в авторской модификации. Для определения свободной 11-ОКС и связывающей способности КСГ использовали метод гельфильтрации De Moor et al. [2] в авторской модификации. Кроликов тестировали через 2 часа после облучения, на 4 и 8 сутки лучевой болезни. Крыс тестировали через час после облучения, на 1, 3, 8 и 10 сутки лучевой болезни. Результаты исследования показали, что острый лучевой синдром протекает на фоне увеличения свободных кортикостероидов, что имеет существенное значение в патогенезе острой лучевой болезни. Увеличение свободных кортикостероидов в разгаре лучевой болезни обусловлено, прежде всего, снижением связывающей способности кортикостероидсвязывающего глобулина (КСГ или транскортина) и не зависит от общей концентрации гормона в плазме крови, что является общей радиобиологической закономерностью. Величина связывающей способности транскортина является показателем белково-стероидного взаимодействия.
Острая лучевая болезнь, кора надпочечников, адренокортикальная реакция, кортикостероиды, плазма крови, белково-стероидное взаимодействие, гиперкортицизм, транскортин, связывающая способность ксг, свободный гормон
Короткий адрес: https://sciup.org/170195743
IDR: 170195743 | УДК: 616-001.28-092+616.453 | DOI: 10.21870/0131-3878-2022-31-3-139-146
Binding capacity of plasma corticosteroid-binding globulin as a mechanism for increasing the free fraction of the hormone in the pathogenesis of acute radiation sickness
The research of the hormonal level of the body in the pathogenesis of acute radiation sickness does not lose its relevance due to the expansion of the list of radiation hazard sources. The study results are necessary for clarification of a number of radiobiology concepts on the role of the binding capacity of plasma corticosteroid-binding globulin to blood plasma proteins for increasing the free fraction of the hormone in the dynamics of acute radiation sickness. Determination of the role of free corticoids in the hormonal effect in acute radiation sickness in animals with mono- and biphasic curves of adrenocortical response to radiation was the aim of the work. The experiments were carried out on male rabbits and outbred rats. Animals received a dose of g-irradiation, that caused acute radiation sickness of the stage IV. The total content of 11-OX, mcg% was determined by the fluorimetric method Guillemin et al. in the author's modification. To determine the free 11-OX and the binding capacity of CSG, the gel filtration method was used by De Moor et al. in the author's modification. Rabbits were tested 2 hours after irradiation, on days 4 and 8 of radiation sickness. Rats were tested one hour after irradiation, on days 1, 3, 8, and 10 of radiation sickness. The results of the study showed that acute radiation syndrome occurs against the background of an increase in free corticosteroids, which is essential in the pathogenesis of acute radiation sickness. The increase in free corticosteroids in the midst of radiation sickness is primarily due to a decrease in the binding capacity of corticosteroid-binding globulin (CSG or transcortin) and does not depend on the total concentration of the hormone in the blood plasma, which is a general radiobiological pattern. The magnitude of the binding capacity of transcortin is an indicator of protein-steroid interaction.
Текст научной статьи Связывающая способность кортикостероидсвязывающего глобулина плазмы крови как механизм повышения свободной фракции гормона в патогенезе острой лучевой болезни
Вопросы реакции различных систем организма на острое лучевое повреждение, регулирующих процессы кортикостероидно-белкового комплексообразования, остаются актуальными как для теории радиобиологии, так и для медико-клинических и радиобиологических исследований. Актуальность проблемы исследования обусловлена обострением угрозы радиационной безопасности населения, что связано с ростом количества предприятий атомной энергетики, ядерно-оружейных объектов, создающих риски возникновения новых ядерных катастроф.
В современных исследованиях подчёркивается системный характер адаптационного ответа гипофизарно-адренокортикальной системы организма на действие ионизирующей радиации [3, 4]. Вопросы кортикостероидно-белкового комплексообразования при остром лучевом синдроме в организме животных и человека в отечественной науке активно изучались, начиная с середины до конца прошлого столетия [5-7]. Однако в настоящее время данная проблематика осталась за пределами научного внимания исследователей. В связи с этим вопросы нарушения гормонального уровня организма в патогенезе острой лучевой болезни требуют своего дальнейшего исследования.
Омельчук Н.Н. - зав. кафедрой, д.б.н., проф. РУДН.
Проблематика белково-стероидного взаимодействия изложена в ряде современных медико-клинических исследований зарубежных учёных, посвящённых изучению механизмов связывания кортикостероидов с белками плазмы крови в гормональном взаимодействии гипоталамо-ги-пофизарно-надпочечниковой системы при различных патологических состояниях организма человека [8-15]. В ряде работ подчёркивается роль свободного гормона, уровень которого демонстрирует целостную картину функционального статуса гипоталамо-гипофизарно-надпочечнико-вой системы человека при различных патологических состояниях организма [16-19]. В патогенезе острой лучевой болезни роль свободной фракции гормона в механизме снижения связывающей способности кортикостероидсвязывающего глобулина (КСГ) плазмы крови показана в ранних авторских публикациях [20]. Таким образом, возникает необходимость уточнения ряда положений радиобиологии о роли КСГ плазмы крови в повышении свободной фракции гормона в динамике острой лучевой болезни, в чём заключается теоретическая значимость настоящего исследования. Обобщение полученных результатов позволит проводить более точный диагноз и прогноз исхода лучевой болезни.
Материалы и методы
Для уточнения роли КСГ плазмы крови в повышении свободной фракции гормона в динамике острой лучевой болезни эксперименты были продолжены на 20 кроликах-самцах породы шиншилла, весом 3,0-3,5 кг и на 475 белых крысах-самцах линии Wistar, весом 180-200 г. Предварительно животные были адаптированы к условиям эксперимента в течение 10-15 дней. В ходе эксперимента животные получили общее γ-облучение на установке ЭГО-2 при средней мощности дозы 5,75 Гр/мин в дозах, вызывающих острую лучевую болезнь IV стадии: кроликов облучали в дозе 8 Гр, крыс – в дозе 8,5 Гр. Сроки наблюдения после облучения в экспериментах на кроликах и крысах были различными. Кроликов тестировали через 2 ч после облучения, на 4 и 8 сутки лучевой болезни. Крыс тестировали через час после облучения, на 1, 3, 8 и 10 сутки лучевой болезни.
Общее содержание 11-ОКС в плазме периферической крови определяли с помощью флюорометрического метода Guillemin et al. [1] в авторской модификации. Для определения свободной фракции 11-ОКС и связывающей способности КСГ использовали метод гельфильтрации и De Moor et al. [2] в авторской модификации. Связывающую способность КСГ, то есть максимальное количество гормона, которое может быть связано с белком, определяли гель-фильтрацией после инкубации 1 мл плазмы с 0,05 мл кортикостерона при комнатной температуре в течение 1 ч. В основе этого метода лежит способность гелевых пористых частиц задерживать с различной степенью интенсивности вещества с разным размером молекул. Принцип разделения свободных и связанных с белками фракций стероидов основан на свойствах геля пропускать сначала вещества с большим молекулярным весом (связанный гормон) и лишь затем низкомолекулярные соединения (свободный гормон). Все другие методы, применяемые для изучения связывания 11-ОКС с белками (ультрафильтрация, равновесный диализ, ультрацентрифугирование), требуют длительного времени, трудоёмки, для них необходимы меченые стероиды. Гель-фильтрация наименее трудоёмка, позволяет определить специфическое связывание 11-ОКС с КСГ, причём в отличие от других методов, даёт возможность измерить абсолютную величину связывания. Применённый метод был проверен на специфичность и подчинение закону Ламберта-Бера
(экстинкция пропорциональна концентрации гормона в диапазоне 0,01-1,0 мкг). Модификация вдвое уменьшила ошибку метода, доведя её до ±0,5 мкг%, а пропускная способность опыта при этом увеличилась в среднем в 3-4 раза. О наличии или отсутствии не связанных с белками кортикостероидов судили по разнице содержания последних в цельной плазме и ее белковой фракции после разделения на сефадексе.
Результаты и их обсуждение
Для выявления роли связывающей способности КСГ плазмы крови в повышении свободной фракции гормона в патогенезе острой лучевой болезни получены результаты, отражающие уровень связывающей способности КСГ и свободной фракции гормона у кроликов после облучения в дозе 8 Гр (рис. 1).
♦ Общий уровень 11-ОКС — » — Связывающая способность КСГ
^^^^^^^^^Свободные 11-ОКС, %
Рис. 1. Изменение общего уровня 11-ОКС (мкг%), связывающей способности КСГ (мкг%) и свободного гормона (%) в плазме крови кроликов после облучения в дозе 8 Гр.
Результаты исследования показали, что в первые часы после облучения величина связывающей способности КСГ практически оставалась равной исходной (12,1 мкг%), а на 4 й и 8 дни лучевой болезни оказывалась заметно сниженной (4,8 мкг% и 5,7 мкг% соответственно). При этом величина свободной фракции гормона на 8-е сутки после облучения уменьшалась (9,1%), причём более чем у половины животных свободная фракция не определялась. Связывающая способность КСГ в этот срок продолжала оставаться на низком уровне.
Одновременное определение связывающей способности КСГ и свободной фракции гормона у кроликов показало, что там, где связывающая способность КСГ превышала общий уровень гормона в крови, свободная фракция отсутствовала; если резервные возможности связывающей способности КСГ были ниже общего уровня гормона, определялась свободная фракция. Несмотря на отсутствие активного гормона в этот период лучевой болезни, резервные возможности КСГ снижены по сравнению с контролем, поэтому любые стрессорные воздействия на этом фоне могут привести к появлению свободной фракции в значительных количествах.
Можно видеть, что у кроликов после облучения общий уровень 11-ОКС в крови повышается, достигая максимума через 2 ч после облучения, после чего возвращается к исходному уровню и в дальнейшем продолжает падать даже ниже нормальных величин, имея характер мо-нофазной кривой. Вторичного гиперкортицизма, по крайней мере, в пределах периода наблюдения (8 дней) у этих животных обнаружить не удалось. Однако, концентрация свободных кортикостероидов повышается в первые часы после облучения и остаётся высокой и на 4-й день болезни и лишь после этого срока относительно нормализуется. Наличие повышенного содержания несвязанного гормона на фоне нормального общего уровня может свидетельствовать о «скрытом» гиперкортицизме в разгаре лучевой болезни. Это повышение активной фракции объясняется обнаруженным в наших экспериментах снижением связывающей способности КСГ в разгар лучевой болезни.
Изменения уровня связывающей способности КСГ, свободного гормона, а также общего уровня 11-ОКС (мкг%) в плазме крови крыс после облучения в дозе 8,5 Гр представлены на рис. 2.
Общий уровень 11-ОКС ^^^^^^^^^Свободные 11-ОКС, %
Связывающая способность КСГ
45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
Рис. 2. Изменение общего уровня 11-ОКС (мкг%), связывающей способности КСГ (мкг%) и свободного гормона (%) в плазме крови крыс после облучения в дозе 8,5 Гр.
Определение связывающей способности КСГ плазмы крови, предпринятое для выяснения механизма повышения свободного гормона, показало, что через час после облучения связывающая способность КСГ у крыс практически не изменялась (40,4 мкг% и 38,5 мкг% соответственно), а в разгаре лучевой болезни неуклонно и достоверно снижалась до 24,1 мкг% на 3 сутки и до 8,8 мкг% на 8 сутки лучевой болезни. Поскольку в первые часы после облучения связывающая способность КСГ не изменялась, содержание свободных кортикостероидов увеличивалось в результате повышения общего содержания гормонов в плазме. Увеличение свободных 11-ОКС независимо от их общего уровня в разгаре лучевой болезни обусловлено резким снижением связывающей способности КСГ плазмы крови.
Заключение
Анализ экспериментальных данных позволил сделать выводы о роли связывающей способности КСГ плазмы крови, выступающей в качестве механизма повышения свободной фракции гормона в патогенезе острой лучевой болезни у животных с моно- и с двухфазной кривой адренокортикальной реакции на облучение.
-
1. Существующее представление о гиперкортицизме при острой лучевой болезни, основанное на двухфазности реакции коры надпочечников, нуждается в уточнении, поскольку практически весь острый лучевой синдром протекает на фоне увеличения свободных биологически активных глюкокортикоидов. У кроликов наблюдалась монофазная кривая, поскольку в пределах времени наблюдения после снижения общего уровня кортикостероидов в крови не отмечалось вторичного гиперкортицизма, напротив, по мере развития лучевой болезни секреция адренокортикальных гормонов у этих животных продолжала снижаться.
-
2. У животных как с моно, так и с двухфазной кривой адренокортикальной реакции на облучение на всём протяжении острой лучевой болезни независимо от колебаний общего уровня кортикостероидов содержание их свободной фракции остаётся повышенным, что особенно проявляется в первые часы после облучения и в разгаре лучевой болезни. Ранний гиперкорти-цизм после облучения определяется повышенной общей секрецией 11-ОКС, превышающей связывающую способность КСГ (последняя в этот период не изменяется), что типично для состояния стресса в независимости от вызывающего его агента. В разгаре лучевой болезни повышенное содержание свободного гормона в крови, наблюдаемое на фоне нормального и даже сниженного общего уровня 11-ОКС, вызвано понижением связывающей способности КСГ, что является общей радиобиологической закономерностью.
Список литературы Связывающая способность кортикостероидсвязывающего глобулина плазмы крови как механизм повышения свободной фракции гормона в патогенезе острой лучевой болезни
- Guillemin R., Clayton G.W., Lipscomb H.S., Smith J.D. Fluorometric of rat plasma and adrenal, corti-costerone concentration; a note on technical details //J. Lab. Clin. Med. 1959. V. 53, N 3. P. 830-832.
- De Moor P., Hoirwegh K., Heromans G., Declerck-Raskin M.M. Protein binding of corticosteroid studied by gel filtration //J. Clin. Invest. 1962. V. 41, N 4. P. 816-827.
- Анохин П.К. Очерки физиологии функциональных систем. М.: Книга по Требованию, 2021. 450 с.
- Гребенюк А.Н., Стрелова О.Ю., Легеза В.И., Степанова Е.Н. Основы радиобиологии и радиационной медицины: Учебное пособие. СПб.: ООО Издательство ФОЛИАНТ, 2012. 232 с.
- Докшина Г.А. Эндокринные и метаболические аспекты лучевой болезни. Томск: Издательство Томского ун-та, 1984. 223 с.
- Мороз Б.Б., Кендыш И.Н. Радиобиологический эффект и эндокринные факторы. М.: Атомиздат, 1975. 228 с.
- Романцев Е.Ф., Блохина В.Д., Кощеенко Н.Н., Филиппович И.В. Ранние радиационно-биохимиче-ские реакции. М.: Атомиздат, 1966. 268 с.
- Fernandez-Real J.M., Pugeat M., Grasa M., Broch M., Vendrell J., Brun J., Ricart W. Serum corticosteroid-binding globulin concentration and insulin resistance syndrome: a population study //J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. V. 87, N 10. P. 4686-4690.
- Gagliardi L., Ho J.T., Torpy D.J. Corticosteroid-binding globulin: the clinical significance of altered levels and heritable mutations //Mol. Cell Endocrinol. 2010. V. 316, N 1. P. 24-34.
- Klieber M.A., Underhill C., Hammond G.L., Muller Y.A. Corticosteroid-binding globulin, a structural basis for steroid transport and proteinase-triggered release //J. Biol. Chem. 2007. V. 282, N 40. P. 29594-29603.
- Lewis J.G., Borowski K.K., Shand B.I., George P.M., Scott R.S. Plasma sex hormone-binding globulin, corticosteroid-binding globulin, cortisol, and free cortisol levels in outpatients attending a lipid disorders clinic: a cross-sectional study of 1137 subjects //Horm. Metab. Res. 2010. V. 42, N 4. P. 274-279.
- Lewis J.G., Elder P.A. Corticosteroid-binding globulin reactive centre loop antibodies recognise only the intact natured protein: elastase cleaved and uncleaved CBG may coexist in circulation //J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2011. V. 127, N 3-5. P. 289-294.
- Mihrshahi R., Lewis J.G., Ali S.O. Hormonal effects on the secretion and glycoform profile of corticosteroid-binding globulin //J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2006. V. 101, N 4-5. P. 275-285.
- Sivukhina E.V., Jirikowski G.F., Bernstein H.G., Lewis J.G., Herbert Z. Expression of corticosteroid-bind-ing protein in the human hypothalamus, co-localization with oxytocin and vasopressin //Horm. Metab. Res. 2006. V. 38, N 4. P. 253-259.
- Zhou A., Wei Z., Stanley P.L., Read P.J., Stein P.E., Carrell R.W. The S-to-R transition of corticosteroid-binding globulin and the mechanism of hormone release //J. Mol. Biol. 2008. V. 380, N 1. P. 244-251.
- Hamrahian A.H., Oseni T.S., Arafah B.M. Measurements of serum free cortisol in critically ill patients //N. Engl. J. Med. 2004. V 350, N 11. P. 1629-1638.
- Lewis J.G., Elder P.A. Intact or «active» corticosteroid-binding globulin (CBG) and total CBG in plasma: determination by parallel ELISAs using monoclonal antibodies //Clin. Chim. Acta. 2013. V. 416. P. 26-30.
- Nguyen P.T., Lewis J.G., Sneyd J., Lee R.S., Torpy D.J., Shorten P.R. Development of a formula for estimating plasma free cortisol concentration from a measured total cortisol concentration when elastase-cleaved and intact corticosteroid binding globulin coexist //J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2014. V 141. P. 16-25.
- Vincent R.P., Etogo-Asse F.E., Dew T., Bernal W., Alaghband-Zadeh J., le Roux C.W. Serum total cortisol and free cortisol index give different information regarding the hypothalamus-pituitary-adrenal axis reserve in patients with liver impairment //Ann. Clin. Biochem. 2009. V. 46, N 6. P. 505-507.
- Омельчук Н.Н. К механизму снижения связывающей способности кортикостероидсвязывающего глобулина плазмы крови при острой лучевой болезни //Радиобиология. 1987. Т. 27, № 4. С. 544-546.
