Свойства водной дисперсии комплекса хитотозана и хондроитина сульфата, полученных из гидробионтов

Практическое применение хитозана – линейного полисахарида, состоящего из (1→4)-связанных остатков 2-амино-2-деокси-β-D-глюкопиранозы – постоянно расширяется, что объясняется его биосовместимостью, биодеградируемостью, нетоксичностью для человеческого организма и ярко выраженной антимикробной активностью. Хондроитина сульфат входит в состав многих лекарственных препаратов, применяемых при заболеваниях суставов. Хондроитина сульфат представляет собой сульфатированный гликозаминогликан с молекулярной массой 10 000–100 000 Да. В хондроитина сульфате дисахаридные фрагменты цепи (хондрозины) связаны β-(1-4) гликозидной связью. Дисахарид хондрозин является мономером хондроитина сульфата и состоит из остатков двух моносахаридов: D-глюкуроновой кислоты и D-галактозамина, связанных между собой β-(1→3)-гликозидной связью.

В результате реакции между противоположно заряженными полиэлектролитами в водных растворах образуются полиэлектролитные комплексы (ПЭК) – нерастворимые стехиометрические и растворимые нестехиометрические. Макромолекулы полиэлектролитов в таких комплексах удерживаются ионными, водородными связями, а также дисперсионными силами.

Простейший способ получения полиэлектролитного комплекса (ПЭК) – смешивание водных растворов, один из которых содержит полианионный, а другой – поликатионный компонент. Хитозан (ХТЗ) в растворе при контакте с хондроитина сульфатами образует полиэлектролитные комплексы за счет прочных электростатических связей между - NH ₃ ⁺ -группами хитозана и -OSO ₃ ^- и –COO ^– -группами хондроитина сульфата (ХС) [1].

Полиэлектролитные комплексы находят применение в медицине, могут быть использованы в качестве матрицы для создания сорбентов и носителей различного назначения, для использования в процессе адсорбционно-флокуляционной очистки воды, в качестве добавки в ветеринарные препараты, повышающие биологическую ценность мяса, в качестве связующих для почв и грунтов, для создания форм с пролонгированным выделением лекарственных веществ [2–7].

Неиспользуемые источники хиндроитина сульфата и хитозана имеются в Мурманской области. Исследование возможности производства хондроитина сульфата и хитозана и полиэлектролитных комплексов на их основе, полученных из местного морского сырья, является актуальным с точки зрения комплексной безотходной технологии переработки природного сырья. Такое производство позволит повысить рентабельность рыбоперерабатывающей промышленности и получить ценные препараты, имеющие применение в медицине, пищевой и косметической промышленности, сельском хозяйстве и др.

Применение комплексов обусловлено их способностью формировать в объеме раствора локальные гидрофильно-гидрофобные области и поведением на межфазных границах. Водные дисперсии комплекса на основе хитозана и хондроитина сульфата могут быть использованы для стабилизации суспензий, эмульсий, для создания пищевых продуктов с лечебно-профилактическими свойствами. В связи с этим в данной работе изучены условия формирования, поверхностные и реологические свойства устойчивых водных дисперсий комплекса ХТЗ и ХС, предложен качественный механизм его формирования в объеме водной фазы.

Материалы и методы

Хитозан был получен из панциря камчатского краба Paralithodes camtschaticus по известной технологии [5]. Степень деацетилирования хитозана составила 68,8 %, молекулярная масса, определенная вискозиметрическим методом, – 368 кДа.

Хондроитина сульфат был выделен из хрящевой ткани семги Salmo salar по технологии, заимствованной из патента [6]. Молекулярная масса, определенная нефелометрическим методом, составила 60 кДа.

Для определения поверхностного натяжения (на границе с воздухом) водных растворов полисахаридов и дисперсии ПЭК использовали метод Вильгельми [8], размер частиц определяли методом дисперсии светорассеяния (метод "спектра мутности") [9; 10].

Измерение эффективной вязкости растворов проводили в условиях сдвиговой деформации [11] на ротационном вискозиметре Brookfield RVDV–II+Pro с термостатируемой измерительной ячейкой в виде двух коаксиальных цилиндров (R _н /R _в = 1,14) в области скоростей сдвига γɺ от 0,93 до 186 с ^–1 при температуре 20 ± 0,1 °С.

Растворы полисахаридов готовили следующим образом: навеску ХТЗ растворяли в 0,5 %-м растворе CH ₃ COOH и оставляли раствор на сутки, ХС растворяли в воде. Таким образом получали 1 %-е растворы полисахаридов. Величина pH приготовленных растворов составляла для хитозана 3,7, для хондроитина сульфата – 6,2. pH раствора хитозана доводили до pH 6,2 раствором NaOH (С = 0,1 моль/дм ³ ). Затем растворы смешивали в молярном соотношении 1 : 6, 1 : 3, 1 : 1, 3 : 1.

Соотношение масс ХС и ХТЗ рассчитывалось из условия стехиометрического связывания – -OSO ₃ ^- и –COO ^– -групп (ХС) и - NH ₃ ⁺ -групп ХТЗ. При расчете учитывалась степень деацетилирования ХТЗ.

Результаты и обсуждение

При смешивании растворов хитозана и хондроитина сульфата происходит образование полиэлектролитного комплекса, который выделяется в виде новой фазы.

При добавлении раствора хондроитина сульфата к раствору хитозана в молярных соотношениях 1 : 3; 1 : 6 образуется дисперсия полиэлектролитного комплекса, устойчивая в течение всего времени наблюдения (до 3 сут).

При молярном соотношении смешиваемых растворов 1 : 1 (независимо от последовательности их смешения) образуется суспензия полиэлектролитного комплекса, затем выпадает осадок.

Результаты изучения физико-химических свойств устойчивой водной дисперсии полиэлектролитного комплекса хитозана и хондроитина сульфата приведены на рис. 1 и в таблице.

На рис. 1 приведена зависимость поверхностного натяжения водных растворов полисахаридов и дисперсии полиэлектролитного комплекса от времени.

Из данных, приведенных на рис. 1, следует, что равновесные значения поверхностного натяжения для исследованных растворов хитозана и хондроитина сульфата устанавливаются примерно за 8–10 мин, для полиэлектролитного комплекса – за 15 мин.

Равновесные значения поверхностного натяжения для полиэлектролитного комплекса (кривая 3) несколько выше, чем у исходных растворов хитозана и хондроитина сульфата. Анализ кинетических зависимостей поверхностного натяжения показывает, что ПЭК снижает поверхностное натяжение на границе "водный раствор – воздух" по сравнению с чистым растворителем до 53 мН/м, что позволяет использовать его для стабилизации дисперсных систем.

Результаты изучения эффективного радиуса частиц Rэф в дисперсии полиэлектролитного комплекса хитозана и хондроитина сульфата приведены в таблице. Предварительно был определен гидродинамический радиус агрегатов макромолекул в 1 %-м растворе полисахаридов. В условиях эксперимента для хитозана он составил 1 452 нм, для хондроитина сульфата – 310 нм. Такого различия следовало ожидать, поскольку молекулярная масса хитозана примерно в 6 раз больше, чем хондроитина сульфата.

Рис. 1. Зависимость поверхностного натяжения водных растворов полисахаридов и полиэлектролитного комплекса от времени: 1 – ХТЗ; 2 – ХС; 3 – ПЭК. Концентрация растворов – 1 %, t = 22 °С, молярное соотношение в комплексе ХС : ХТЗ = 1 : 3

Таблица

Эффективный радиус частиц R эф в дисперсии полиэлектролитного комплекса хитозана и хондроитина сульфата

Мольное отношение хондроитина сульфата и хитозана	Эффективный радиус (нм) через время формирования ПЭК (мин)
	1	30	60	1 440
1 : 3	139	137	138	121
1 : 6	176	378	378	279,8

Из данных, приведенных в таблице, следует, что R _эф комплекса зависит от молярного соотношения ХС : ХТЗ. С увеличением содержания хитозана в исходном растворе R эф увеличивался в 1,2 раза через одну минуту после сливания растворов и в 2,5 раза через 30–60 мин с момента начала формирования комплекса. Это, по всей видимости, можно объяснить различием в молекулярной массе хитозана и хондроитина сульфата: с увеличением содержания более высокомолекулярного компонента R _эф увеличивается.

Изучение кинетики комплексообразования показало, что при молярном соотношении ХС : ХТЗ = 1 : 3 комплекс формируется практически сразу. Через сутки наблюдается некоторая компактизация комплекса (R эф уменьшается до 121 нм).

При молярном соотношении ХС : ХТЗ = 1 : 6 время формирования комплекса составляет примерно 30 мин (R _эф увеличивается до 378 нм), затем средний эффективный радиус частиц комплекса практически не меняется.

На основании полученных результатов можно предложить качественную схему формирования полиэлектролитного комплекса хитозана с хондроитина сульфатом в водных дисперсиях и образование нерастворимого осадка при смешении хитозана с хондроитина сульфатом (рис. 2).

При образовании нерастворимого осадка (добавление хитозана к хондроитина сульфату) хондроитина сульфат оказывается внутри комплекса, возможно также образование поперечных "сшивок". При образовании устойчивой дисперсии (добавление хондроитина сульфата к избытку хитозана) комплекс состоит из "ядра" и защитного слоя из макромолекул хитозана и хондроитина сульфата, которые обеспечивают устойчивость дисперсии в течение длительного времени.

Результаты реологических измерений для водных растворов хитозана, хондроитина сульфата и дисперсии полиэлектролитного комплекса приведены в виде кривых течения – зависимостей эффективной вязкости η и напряжения сдвига τ от скорости сдвига γɺ (рис. 3, 4). Кривые течения в диапазоне скоростей сдвига от 0,93 до 186 с–1 приведены в логарифмических координатах.

Раствор хондроитина сульфата добавлен к избытку раствора хитозана (устойчивая водная дисперсия)

Раствор хитозана добавлен к раствору хондроитина сульфата (1:1)

Защитный слой макромолекул

Хитозан "снаружи" макромолекул: хондроитина сульфата

Хондроитина сульфат "снаружи1 макромолекулы хитозана

Рис. 2. Качественная схема формирования полиэлектролитного комплекса хитозана с хондроитина сульфатом в водных дисперсиях

Осадок нерастворимого ПЭК

Рис. 3. Кривые течения η = f ( γɺ ) растворов хитозана (С = 1 %), хондроитинсульфата (С = 1 %) и раствора ПЭК в логарифмических координатах, t = 20 °С: 1 – ХТЗ; 2 – ХС; 3 – ПЭК (молярное соотношение ХС : ХТЗ = 1 : 3); 4 – ПЭК (молярное соотношение ХС : ХТЗ = 1 : 6)

Реологическое поведение исследованных 1 %-х растворов хитозана и хондроитина сульфата демонстрируют кривые 1 и 2 на рис. 3 и 4. Эффективная вязкость раствора хитозана примерно в 10 раз превышает вязкость раствора хондроитина сульфата во всем исследованном диапазоне скоростей сдвига. Это, по всей видимости, объясняется значительным различием в молекулярной массе полисахаридов (368 и 60 кДа соответственно).

Рис. 4. Кривые течения τ = f ( γɺ ) растворов хитозана (С = 1 %), хондроитинсульфата (С = 1 %) и раствора ПЭК в логарифмических координатах, t = 20 °С. Экспериментальные данные (точки) аппроксимированы моделью Оствальда – де Виля. 1 – ХТЗ; 2 – ХС; 3 – ПЭК

(молярное соотношение ХС : ХТЗ = 1 : 3); 4 – ПЭК (молярное соотношение ХС : ХТЗ = 1 : 6)

Характер реологического поведения также различный. Для раствора хитозана в условиях эксперимента вязкость практически не зависит от скорости сдвига (эффективная вязкость изменяется незначительно от 0,19 до 0,14 Па·с).

Для раствора хондроитина сульфата вязкость уменьшается, достигая минимального значения при γɺ = 186 с ^–1 . Вероятно, в объеме раствора хондроитина сульфата образуются непрочные коагуляционные структуры из макромолекул полисахарида, которые легко разрушаются при увеличении скорости сдвига.

Реологическое поведение водных 1 %-х дисперсий полиэлектролитного комплекса при различных молярных соотношениях ХС : ХТЗ демонстрируют кривые 3 и 4 (рис. 3, 4). Из этих данных следует, что водные растворы полиэлектролитного комплекса ведут себя как неньютоновские жидкости, для которых вязкость уменьшается во всем исследованном диапазоне скоростей сдвига, достигая минимальных значений при γɺ = 93 с ^–1 .

При молярном соотношении ХС : ХТЗ = 2,5 : 17 максимальная вязкость раствора полиэлектролитного комплекса практически одинакова с вязкостью исходного 1 %-го раствора хитозана (≈ 0,2 Па·с).

Минимальные значения вязкости водных дисперсий полиэлектролитного комплекса при молярных соотношениях ХС : ХТЗ = 2,5 : 17 и 5 : 17 практически совпадают (0,012 и 0,015Па·с).

Кривые течения растворов хитозана, хондроитина сульфата и водной дисперсии полиэлектролитного комплекса были аппроксимированы с помощью модели Оствальда – де Виля (рис. 2) [12; 13], τ = k · γɺ ⁿ , где n – индекс течения; k – коэффициент консистенции.

Коэффициент парной корреляции составил 0,9977 (для молярного соотношения ХС : ХТЗ = 2,5 : 17) и 0,9975 (для молярного соотношения ХС : ХТЗ = 5 : 17). Значение индекса течения n в уравнении Оствальда – де Виля для всех изученных растворов находится в пределах 0 <  n < 1 (для раствора хитозана значение n близко к единице 0,9446).

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что водные дисперсии полиэлектролитного комплекса при изученных молярных соотношениях хондроитина сульфата и хитозана ведут себя как псевдопластичные неньютоновские жидкости.

Заключение

• 1.    Впервые изучены коллоидно-химические свойства ПЭК на основе ХС и ХТЗ, полученных из гидробионтов Баренцева моря.

• 2.    При взаимодействии хитозана и хондроитина сульфата образуется осадок, в котором молярное соотношение этих полиэлектролитов остается постоянным, приблизительно 1 : 1, что объясняется образованием комплекса, в котором все аминогруппы хитозана соединены со всеми карбоксильными и сульфатными группами хондроитина сульфата; при добавлении раствора хондроитина сульфата к раствору хитозана в молярном соотношении 1 : 3; 1 : 6 образуется дисперсия полиэлектролитного комплекса, сохраняющая устойчивость в течение 2–3 сут.

• 3.    Равновесные значения поверхностного натяжения водной дисперсии полиэлектролитного комплекса выше, чем у растворов хондроитина сульфата и хитозана. Эффективный радиус частиц в дисперсии полиэлектролитного комплекса зависит от молярного соотношения хондроитина сульфат : хитозан.

• 4.    Предложена качественная схема формирования полиэлектролитного комплекса хитозана с хондроитина сульфатом в виде нерастворимого осадка и в виде устойчивой водной дисперсии.

• 5.    Установлено, что водные дисперсии полиэлектролитного комплекса при изученных соотношениях хондроитина сульфата и хитозана ведут себя как псевдопластичные неньютоновские жидкости, реологическое поведение которых может быть описано с помощью модели Оствальда – де Виля.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (Проект № 16-16-00076).