Таксономическое разнообразие микробного сообщества холодного железистого источника Дабан-Горхон (Витимское плоскогорье)

Жизнь на Земле развивалась в холодных условиях. Самая большая часть глобальной биосферы представлена сообществами, растущими и выживающими при температуре ниже 5 °C [Siddiqui & Cavicchioli 2006; Margesin & Miteva, 2011]. Психрофильные микроорганизмы являются естественными обитателями холодной среды. Исследования в области микробной экологии холодной среды с помощью культурозависимых и независимых от культуры молекулярных методов получили широкое распространение и сформировали комплекс знаний о разнообразии и экологической роли микробных сообществ в холодных экосистемах. Постоянно холодные наземные источники широко распространены и разнообразны по гидрохимическому составу, рН и минерализации. Однако микробные сообщества данных экосистем в настоящее время еще малоизучены [Rudolph et al., 2001, Camacho et al., 2005, Perreault et al., 2007; Perreault et al., 2008, Chaudhary et al., 2009, Li et al., 2012; Guðmundsdóttir et al., 2019]. Исходя из задач микробной экологии, одной из которых является получение представления об особенностях распространения микроорганизмов в различных местах их обитания, необходимо расширять сведения и знания о разнообразии и функционировании микробных сообществ в постоянно холодных наземных источниках.

Целью данной работы было изучение таксономического разнообразия микробных сообществ воды и донных осадков в постоянно холодном железистом источнике Дабан-Горхон (Витимское плоскогорье).

Материал и методика

Дабан-Горхонский холодный железистый источник (52°25′277 ” N 111°48′422 ” E) находится на левобережье реки Уды, в 22 км от села Сосново-Озерское (Еравнин-ский район, Бурятия). Источник имеет чашеобразную воронку диаметром 10–12 м. Вода здесь применяется в лечебных целях при различных заболеваниях.

Пробы воды и донных осадков были отобраны в стерильную стеклянную и пластиковую посуду. Температуру и значения рН в воде измеряли портативным прибором «РН-200» (HM Digital, Китай), минерализацию тест-кондуктометром TDS-4 (Сингапур). Концентрация анионов и катионов, перманганатная окисляемость и жесткость в воде были определены общепринятыми гидрохимическими методами [Унифицированные методы... 1973].

Для выделения ДНК воду фильтровали до забития фильтра через нитроцеллюлозные фильтры (диаметр пор 0,22 мкм). Тотальную ДНК с фильтров извлекали с помощью механической гомогенизации и ферментативного лизиса [Белькова, 2009]. Для выделения ДНК из проб донных осадков использовали набор реактивов MACHEREY-NAGEL Nucleo Spin Soil (MACHEREY-NAGEL, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Качественную оценку выделенной ДНК проверяли на приборе Nano Drop 8000 (Thermo Fisher Scientific Inc, США). Концентрацию ДНК определяли на флуориметре Quantus (Promega, США) с применением набора Quanti Fluords DNA (Promega, США).

Высокопроизводительное секвенирование. ДНК-библиотеки для секвенирования были созданы с использованием праймеров к вариабельной области V3–V4 гена 16S рРНК S-D-Bact-0341-b-S-17 и S-D-Bact-0785-a-A-21

согласно протоколу Illumina chemistry_documentation/16s/ [Klindworth et al., 2013]. Секвенирование проводили в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН на секвенаторе Mi Seq (Illumina, США) с использованием Reagent Kit V3 PE600 (Illumina, США).

Качество прочтений оценивали с помощью программы Fast QC v0.11.5. Объединение парноконцевых ридов в контиги (объединенные риды) проводили с использованием программы PEAR [Zhang, 2014]. Для фильтрации объединенных ридов по качеству и длине использовали команду fastq_filtr в программе USEARCH v9.0.1623_win32 [Edgar, 2010]. Последовательности были сгруппированы в OTU (operational taxonomic unit) путем последовательной дерепликации и кластеризации на уровне 97 %, с использованием алгоритма UPARSE [Edgar, 2013]. В процессе кластеризации тестировали и удаляли химерные последовательности. Количественная представленность полученных ОТU в образцах оценивалась через глобальное выравнивание последовательностей ОТU на первоначальные объединенные риды. Из полученных данных исключали последовательности, встречающиеся однократно (синглтоны) или дважды (даблтоны).

Для оценки характеристик разнообразия микробных сообществ были рассчитаны индексы разнообразия с использованием программы Past 3.14 с предварительной нормализацией переменных [Hammer et al., 2001].

Результаты и обсуждение

Вода Дабан-Горхонского источника характеризуется как гидрокарбонатная, кальциево-магниево-натриевая с содержанием железа 2,16 мг/л, с температурой 8 °С в летний период (табл. 1). Вода щелочная (рН 8,99); минерализация составляла 700,3 мг/л, средняя жесткость — 7,40 °Ж. Перманганатная окисляемость была 5,70 мг О/л.

C использованием высокопроизводительного гена 16S рРНК профилирования установлено таксономическое разнообразие микробного сообщества воды и донных осадков холодного источника Дабан-Горхон (Витимское плоскогорье). В исследуемых сообществах воды DG_water и донных осадков значительная доля принадлежала бактериям филумов Proteobacteria (46 % и 24 %), Bacteroidota (27 % и 10 %), Actinobacteriota (13,7 % и 17,7 %) соответственно (рис. 1).

Таблица 1

Физико-химическая характеристика воды Дабан-Горхонского источника

Показатель, единица измерения	Значение показателя
Температура, °С	8,0
Водородный показатель (рН)	8,99
Общая минерализация, мг/л	700,3
Окисляемость перманганатная, мг О/л	5,7

Продолжение табл. 1

Показатель, единица измерения	Значение показателя
Жесткость общая, °Ж	7,4
Na+, мг/л	27,7
Ca2+, мг/л	100,2
Mg2+, мг/л	29,2
Fe3+, мг/л	2,2
НСО 3 -, мг/л	457,6
СО 3 2-, мг/л	12,0
NO2-, мг/л	<0,02
NO 3 -, мг/л	0,26
SO 4 2-, мг/л	25,3
Cl-, мг/л	10,3
F 2 , мг/л	<0,1
Кремниевая кислота, мг/л	56,8
СО 2 связанная, мг/л	— 165,0

Рис. 1. Состав микробного сообщества на уровне филумов в воде (DG_water) и донных осадках (DGsed) холодного источника Дабан-Горхон

Для оценки характеристик разнообразия микробных сообществ воды и донных осадков источника Дабан-Горхон были рассчитаны индексы разнообразия

Шеннона, Simpson_1-Dи Chao1 (табл. 2). Оценка индексов разнообразия выявила большее разнообразие в микробном сообществе донных осадков.

Таблица 2

OTU и индексы α-разнообразия микробных сообществ холодного источника Дабан-Горхон

Индекс	DG_water	DG_sed
OTUs	16157	13533
Simpson_1-D	0,9802	0,9879
ShannonH	4,931	5,471
Chao-1	416	547

В результате анализа микробного сообщества воды исследуемого источника на уровне семейств/родов установлено преобладание представителей рода Flavobacterium (20 %) семейства Flavobacteriaceae (рис. 2). В сообществе донных осадков доля представителей Flavobacterium была ниже (2,9 %), но также входила в число доминантов (рис. 3). Flavobacterium широко распространены в различных средах умеренных и полярных регионов и являются одним из наиболее представленных родов в арктических и антарктических морских льдах [Liu et al., 2019].

• ■    unclassified Intrasporangiaceae

• ■    unclassified Microbacteriaceae

• ■    unclassified Micrococcaceae

• ■    Nocardioidaceae;Nocardioides

• ■    Chitinophagaceae;Ferruginibacter

Flavobacleriaceae;Flavobaclerium

• ■    Weeksei laceae;Chryseobacteri um

• ■    Sphingobacteriaceae;Pedobacter

• ■    unclassified Bacteroidia

• ■    Arcobacteraceae;Pseudarcobacter

• ■    Caulobacteraceae;Brevundimonas Devosiaceae;Devosia

• ■    unclassified Rhodobacteraceae

• ■    Sphingomonadaceae;Sphingomonas Sphingomonadaceae;Sphingorhabdus Comamonadaceae; Polaromonas unclassified Comamonadaceae unclassified Methylophilaceae

• ■    Oxalobacleraceae;Massilia unclassified Burkholderiales Methylomonadaceae;Metbvlobacter unclassified Methylomonadaceae

• ■    Xanlhomonadaceae;Arenimonas

Рис. 2. Таксономическое разнообразие микробного сообщества на уровне семейство/род в воде холодного источника Дабан-Горхон

DG sed

• ■    unclassified ntrasporangiaceae

• ■    unclassified Microbacteriaceae unclassified Micrococcaceae

• ■    Chitinophagaceae;Ferruginibacter Flavobacteriaceae;Flavobacterium

• ■    unclassified Bacteroidia Geobacteraceae;Geobacter

• ■    unclassified Geobacteraceae

• ■    Nitrospiraceae;Nilrospira

Coma monadaceae; Paucibacter Coma monadaceae; Polaromonas unclassified Comamonadaceae unclassified Burkholderiales

Methylomonadaceae;Methylobacter unclassified Methylomonadaceae Unclassified

Other

Рис. 3. Таксономическое разнообразие микробного сообщества на уровне семейство/род в донных осадках холодного источника Дабан-Горхон

В исследуемых сообществах были выявлены последовательности, установленные как представители семейства Comamonadaceae (5–10 %). Среди Comamonadaceae были определены представители рода Polaromonas . Характерно, что виды Polaromonas чаще всего связаны с холодными и/или бедными питательными веществами местообитаниями, включая ледниковые талые воды и отложения [Gawor et al., 2016]. В исследуемых сообществах также были обнаружены метанотрофы рода Methylobacter (3 % — DGwater, 1,5 % — DG_sed), ближайшие гомологи которых были выделены в основном из водно-болотных экосистем, характеризующихся низкими температурами и олиготрофностью [Chowdhury et al., 2013].

В сообществах воды и донных осадков источника Дабан-Горхон была выявлена значительная доля последовательностей, не классифицированных на разных таксономических уровнях. Высокий процент (1–8 %) был представлен актинобактериями семейств Intrasporangiaceae , Micrococcaceae , Microbacteriaceae . Также высокий процент в сообществах был отнесен к неклассифицированным — Burkholderiales (4 % в обоих сообществах). Однако в результате нашего анализа по базе данных NCBI и Ez Bio Cloud сиквенс, назначенный как « Gammaproteo-bacteria ; unclassified_Burkholderiales», был отнесен к Betaproteobacteria ; семейство Gallionellaceae . Известно, что семейство Gallionellaceae включает аэробные железоокисляющие бактерии, распространенные в местах выхода в ксилород-ную атмосферу анаэробных грунтовых вод, содержащих двухвалентное железо.

В микробном сообществе донных осадков была выявлена значительная доля бактерий рода Geobacter (7,6 %). Бактерии рода Geobacter способны восстанавливать трехвалентное железо [Nevin et al., 2005]. Для сообщества воды характерной особенностью была высокая представленность бактерий рода Brevundimonas семейства Caulobacteraceae (>3 %). Brevundimonas встречается в различных средах обитания, таких как почвы, глубокие подводные отложения, активный ил, черный песок, водные среды. Отмечено, что Brevundimonas активно развиваются и функционируют в олиготрофных условиях [Epova et al., 2022]

Проведенные исследования выявили в микробных сообществах воды и донных осадков источника Дабан-Горхон высокий процент неклассифицированных последовательностей (8–29 % unclassified), которые не имеют никакого сходства с известными последовательностями прокариот, доступными в базах данных.

Заключение

Источник Дабан-Горхон является постоянно холодным источником. Вода источника характеризуется как гидрокарбонатная, кальциево-магниево-натриевая с содержанием железа 2,16 мг/л.

Проведенные молекулярные исследования таксономического разнообразия микробных сообществ воды и донных осадков источника Дабан-Горхон выявили преобладание протеобактерий. Было установлено, что исследуемые микробные сообщества имеют как сходства, так и различия на уровне семейств.

Результаты исследования таксономического разнообразия микробного сообщества воды и донных осадков холодного источника Дабан-Горхон показали, что основу данных сообществ составляют бактерии, чьи ближайшие гомологи были обнаружены в низкотемпературных пресноводных экосистемах. Широкое распространение в исследуемых сообществах бактерий цикла железа вероятно связано с присутствием железа в воде. Большая доля неклассифицированных последовательностей в исследуемых сообществах предполагает высокий потенциал для выделения новых бактериальных таксонов.