Технологический прием при получении сыворотки против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи крупного рогатого скота

Введение. Респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота распространены повсеместно, характеризуются острым течением и являются одной из причин гибели животных [1, 2]. Наиболее распространенными из них являются инфекционный ринотрахеит (ИРТ), парагрипп-3 (ПГ-3), вирусная диарея болезнь слизистых оболочек (ВД-БС), респираторносинцитиальная инфекция (РСИ) крупного рогатого скота [3–5].

Иммунизация взрослого поголовья крупного рогатого скота (КРС) против острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) часто не решает проблемы защиты телят от вирусных инфекций по ряду причин, связанных с недостаточным количеством антител в молозиве матери, несвоевременным его выпаиванием, нарушением абсорбции иммуноглобулинов в кишечнике [6]. Поэтому пассивная иммунизация высокоактивной поливалентной сывороткой, содержащей соответствующие вирусно-бактериальному фону хозяйства антитела, для защиты новорожденных телят от инфекций является неотъемлемой частью специфической профилактики и лечения вирусных респираторных инфекций молодняка КРС. Для этого успешно применяются различные сывороточные препараты, получаемые посредством гипериммунизации животных [7]. Успех гипериммунизации доноров-продуцентов во многом зависит не только от тщательного их подбо- ра, качества антигена и адьювантных веществ вакцины, но и от правильно выбранной схемы гипериммунизации.

Цель исследований – усовершенствовать технологию получения гипериммунной сыворотки против респираторных вирусных инфекций крупного рогатого скота и обеспечить ее высокое качество.

Задачи: оптимизировать схему гипериммунизации и эксплуатации животных-доноров; оценить эффективность ревакцинации доноров в разные сроки после забора крови по титру антител к вирусам ПГ-3, ИРТ, ВД-БС КРС.

Объекты и методы. Научно-производственный опыт по оптимизации схем вакцинации животных-продуцентов для изготовления гипериммунных сывороток против ОРВИ КРС проводили по ранее запатентованной технологии [8] в ФГБНУ ФАНЦА отдел ВНИИПО, хозяйствах Алтайского края. Для этого сформировали 4 опытных группы лактирующих коров-доноров с низкой продуктивностью. Доноров предварительно исследовали на инфекционные болезни согласно действующей инструкции «О порядке заготовки и санитарной обработки животных, используемых для производства биопрепаратов», а также на наличие вируснейтрализующих антител к вирусам ПГ-3, ИРТ, ВД-БС КРС, в О-1 и О-4 группе находились животные с отсутствием антител к вышеуказанным вирусам, а в

О-2 и О-3 группу входили животные с наличием антител к антигенам ПГ-3, ИРТ и ВД-БС. Иммунизацию животных опытных групп проводили с использованием «Вакцины, ассоциированной против парагриппа-3, инфекционного ринотра-хеита и вирусной диареи крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная» ФГБУ ВНИИЗЖ (г. Владимир) (№ рег. удост.12-1-4.16-3108, № ПВР 1-4.0/02669, СТО 00495527-0151-

2019), в увеличивающих дозах подкожно, в область нижней трети шеи, по схеме, приведенной в таблице 1. Оценку воздействия забора крови в процессе вакцинации и ревакцинации животных-продуцентов проводили по клинико-физиологическому состоянию животных (развитию поствакцинальных осложнений), общепринятым в ветеринарии методам клинического обследования.

Таблица 1

День	Вакцинация, забор крови	Вакцина ассоциированная против ПГ-3, ИРТ и ВД-БС КРС эмульсионная инактивированная, доз
		О-1	О-2	О-3	О-4
1	I вакцинация	4	4	4	4
7	II вакцинация	6	6	6	6
14	III вакцинация	8	8	8	8
28	Взятие крови, ревакцинация	+ –	+ 8	+ 8	+ –
35	Ревакцинация	8	–	–	8
49	Взятие крови, ревакцинация	+ –	+ 8	+ 8	+ –
56	Ревакцинация	8	–	–	8
70	Взятие крови, ревакцинация	+ –	+ 8	+ 8	+ –
77	Ревакцинация	8	–	–	8
91	Взятие крови	+	+	+	+

Схема иммунизации и забора крови от животных-доноров

Забор крови до 6 л от каждого реципиента проводили в асептических условиях для изготовления поливалентной сыворотки спустя 28, 49, 70, 91 дней от начала иммунизации, в это же время были отобраны пробы крови: на морфологические исследования – определение общего количества эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина [9]; биохимические исследования сыворотки крови – содержание общего количества белка рефрактометрическим (ИРФ-22); фракции белка – нефелометрическим методом [10]; эффективность вакцинации оценивали по титру сывороточных антител к вирусу парагриппа-3 КРС в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), ИРТ и ВД-БС КРС – в реакции непрямой гемагг- лютинации (РНГА). Методические указания по применению набора эритроцитарного диагности-кума для серодиагностики ИРТ КРС в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) – в ТУ-10-19-327-92, эритроцитарного диагностикума для серодиагностики ВД КРС в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) – в ООО «Агровет» (Москва).

Достоверность средних значений оценивали по Стьюденту-Фишеру.

Результаты и их обсуждение. Данные исследований сыворотки крови от животных-доноров во время формирования опытных групп на наличие специфических антител к вирусу ПГ-3, ИРТ, ВД-БС КРС представлены в таблице 2.

Титр сывороточных антител к вирусам ПГ-3, ИРТ, ВД-БС КРС

Таблица 2

Группа	Титр антител к вирусу (% от числа участвующих в опыте)
	ПГ-3	ИРТ	ВД-БС
О-1 n = 6	–	–	–
О-2 n = 6	1:8 (50) 1:16 (50)	1:4 (33) 1:8 (67)	1:4 (100)
О-3 n = 7	1:8 (42) 1:16 (58)	1:4 (40) 1:8 (60)	1:4 (100)
О-4 n = 6	–	–	–

Трехкратная иммунизация продуцентов ассоциированной вакциной против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи крупного рогатого скота в увеличивающихся дозах через 14 дней после последнего введения обеспечивает повышение антигемагглютининов в сыворотке крови к вирусу ПГ-3 в среднем разведении 1:48 и 1:45 в О-1 и О-4 группах, с достоверным увеличением во О-2 группе (Р ≤ 0,01) по отношению к животным О-1 группы, соответственно в О-3 группе к донорам О-4 в 6,6–6,4 раза

и в 20,0–18,2 раза по отношению к исходным значениям. Соответственно к вирусу ИРТ в среднем титр антител составил 1:72 и 1:80 в О-1 и О-4 группах животных, а в О-2 и О-3 увеличился в 13,2 и 12,5 раз в сравнении с исходными показателями. Титр вируснейтрализующих антител к ВД-БС у животных О-1 и О-4 групп в среднем составил 1:64–1:85, в О-2 увеличился в 37,2 раза, в О-3 группе животных – в 41 раз (Р ≤ 0,01) (табл. 3).

Титры специфических антител к вирусам ПГ-3, ИРТ, ВД-БС КРС

Таблица 3

Инфекция	Группа
	О-1	О-2	О-3	О-4
1	2	3	4	5
Через 28 дней от начала иммунизации
ПГ-3	1:16–1:64 1:48±24,7	1:128–1:512 1:320±210,3**	1:128–1:512 1:292±205,2**	1:8–1:64 1:45±28,9
ИРТ	1:16–1:128 1:72±61,3	1:64–1:128 1:106±33,0	1:64–1:128 1:100±34,2	1:32–1:128 1:80±52,5
ВД-БС	1:32–1:128 1:64±49,5	1:64–1:256 1:149±87,4	1:128–1:256 1:164±62,4**	1:64–1:128 1:85±33,0
Через 49 дней от начала иммунизации
ПГ-3	1:64–1:512 1:309±223,2	1:256–1:1024 1:725±340,0**	1:512–1:1024 1:877±249,8*	1:128–1:512 1:332±171,7
ИРТ	1:32–1:512 1:346±198,7	1:128–1:512 1:362±170,0	1:256–1:512 1:438±124,9	1:64–1:512 1:394±191,6
ВД-БС	1:128–1:256 1:170±66,0	1:128–1:512 1:362±170,0**	1:128–1:512 1:384±165,0**	1:128–1:512 1:277±125,0
Через 70 дней от начала иммунизации
ПГ-3	1:128–1:512 1:320±210,3	1:512–1:1024 1:768±280,4**	1:512–1:1024 1:950±280,4	1:256–1:512 1:384±140,2
ИРТ	1:128–1:512 1:362±170,1	1:256–1:512 1:384±140,2	1:256–1:512 1:475±96,7	1:128–1:512 1:405±170,1
ВД-БС	1:128–1:256 1:192±70,1	1:256–1:512 1:384±140,2**	1:256–1:512 1:438 ±124,9	1:256–1:512 1:341±132,1

Окончание табл. 3

1	2	3	4	5
Через 91 день от начала иммунизации
ПГ-3	1:128–1:512	1:512–1:1024	1:512–1:1024	1:256–1:512
	1:384±198,2	1:938±209,6*	1:950±280,4*	1:426±132,0
ИРТ	1:256–1:512	1:256–1:512	1:512–1:512	1:256–1:512
	1:426±132,1	1:426±132,1	1:512±0,0	1:469±104,5
ВД-БС	1:128–1:256	1:256–1:512	1:256–1:512	1:256–1:512
	1:234±52,2	1:469±104,5	1:469±104,5*	1:426±132,1

* Р ≤ 0,05, **Р ≤ 0,01.

Наличие вируснейтрализующих антител в процессе гипериммунизации доноров по предложенной схеме в сравнении с предыдущим взятием крови выглядит следующим образом. Через 49 дней титр антител к вирусу ПГ-3 в О-1 группе увеличился в 6,4 раза, соответственно в О-2 – в 2,2 раза (Р ≤ 0,01), в О-3 – в 3 раза (Р ≤ 0,05), в О-4 – в 7,3 раза в сравнении с результатами исследований сыворотки крови на 28-й день взятия крови. В 70-й день взятия крови по отношению к 49-му дню количество вируснейтрализую-щих антител в сыворотке животных О-1 группы увеличилось на 3,5 %, в О-2 – на 5,9 (Р ≤ 0,01), в О-3 – на 8,3; в О-4 – на 15,6 %. На 91-й день, соответственно в О-1 – на 20,0 %; во О-2 – на 22,1 (Р ≤ 0,05); в О-3 титр антител к вирусу ПГ-3 остался на прежнем уровне с достоверной разницей (Р ≤ 0,01) к О-1 группе животных, в О-4 группе – на 10,9 %. К вирусу ИРТ количество специфических антител в сыворотке крови животных-доноров на 49-й день увеличилось в 4,8 раза в О-1 группе, в О-2 – в 3,0; в О-3 – в 4,3; в О-4 – в 4,9 раза. В 70-й и 91-й день титр антител к вирусу ИРТ увеличился в О-1 группе животных-продуцентов на 4,6–17,6 %; в О-2 – на 6,0–10,9; в О-3 – на 8,4–7,7 и в О-4 – на 2,7– 15,8 %. Сывороточные антитела к ВД-БС на 49-й день в О-1 группе доноров увеличились в 2,6 раза; в О-2 – в 2,4 (Р ≤ 0,01); в О-3 – в 2,3 (Р ≤ 0,01); в О-4 – в 3,2 раза, соответственно на 70–91-й день исследования в сыворотке крови опытных животных отмечали увеличение титра антител: в О-1 группе – на 12,9–21,8 %; в О-2 – на 6,0–22,1; в О-3 – на 14,0–7,0 (Р ≤ 0,05); в О-4 группе – на 23,1–24,9 %.

В процессе иммунизации доноров-продуцентов меняется и биохимический состав сыворотки крови, после первых 3 заборов крови регистрировали увеличение количества гамма- и бета- глобулиновых фракций при уменьшении содержания альбуминов до 30,0–35,0 %. В это же время установлено повышение лизоцимной и бактерицидной активности сыворотки крови соответственно на 35,7 и 46,5 % в сравнении с исходными данными. Эритропоэз и лейкопоэз на протяжении всего эксперимента характеризовался волнообразным изменением к нижним и средним границам референтных значений.

Для получения сыворотки с достаточно высокими титрами большое значение имеет схема иммунизации и выбор животных-продуцентов. В нашем случае подбор продуцентов с наличием сывороточных антител (О-2 и О-3) к вводимой вакцине оказался более удачным и уже после первого цикла 3-кратного введения малых доз антигена позволил получить сыворотку с достаточно хорошим содержанием антител, что является важным фактом при изготовлении гипериммунных сывороток.

По завершении начального цикла гипериммунизации следовал 1 забор крови с ревакцинацией в это же день в О-3 и О-4 группах, а в О-1 и О-2 – с интервалом 7 дней. Животным-продуцентам предоставлялся отдых в 21 день между взятиями крови. Однократная промежуточная ревакцинация конечной дозой антигена на сенсибилизированном животном давала возможность вновь получать сыворотку в увеличивающихся титрах, а последующие умеренные кровопускания никак не отразились на физиологическом состоянии коров-продуцентов, по окончании научно-производственного опыта животные остались в стаде для дальнейшей эксплуатации.

Известен способ получения гипериммунной сыворотки против парагриппа-3 крупного рогатого скота: здоровых 1,5-летних быков иммунизируют путем внутривенного введения антигена через каждые 5 дней в дозах соответственно 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 40 мл. Спустя 6 дней после 7-й инъекции от быков-доноров получают кровь. При титровании сывороток крови быков установлена вируснейтрализующая активность в разведениях 1:256–1:1024. Известен также способ получения гипериммунной сыворотки против парагриппа-3 крупного рогатого скота, отличающийся тем, что быков иммунизируют вакциной «Паравак» через каждые 7 дней, причем вакцину вводят интраназально, 1 раз по 2 мл в каждую ноздрю, затем подкожно 3 раза – 5; 6; 7 мл и внутривенно 2 раза – 10; 15 мл, через 2 недели после последнего введения вакцины из крови получают сыворотку. Предложенный нами способ менее трудоемкий, первое взятие крови производится на 13–28 дней раньше, чем в представленных выше способах. Проведение ревакцинации (О-2 и О-3 группах) в день взятия крови позволяет сократить время ветеринарных специалистов и обслуживающего персонала на фиксацию животных, снижается стрессовая нагрузка на животных-доноров, при этом антиге-магглютенины к вирусу ПГ-3 находятся в пределах 1:512–1:1024, специфические антитела к вирусу ИРТ и ВД-БС – в титрах 1:256–1:512.

Заключение. Установлено, что проведение ревакцинации коров-доноров сразу после забора крови позволяет получить гипериммунную сыворотку с достаточно высокими средними значениями титра специфических антител к вирусу ПГ-3: в О-2 группе в 2,5 раза выше, чем в О-1, соответственно в О-3 в 2,2 раза выше по сравнению с О-4 группой, к вирусу ИРТ – на 9,0 %. Титр вируснейтрализующих антител к ВД-БС во О-2 группе по отношению к О-1 увеличился в 1,9 раза, в О-3 соответственно к О-4 – на 10,0 %. Лактирующие коровы-доноры по окончании научно-производственного опыта находились в удовлетворительном состоянии и остались в стаде для дальнейшей эксплуатации.