Технологии производства товарной формы препарата нефтедеструктора «Родер» и эффективность применения этих форм в лабораторных условиях и в природе

Экологическое состояние природы оказывает значительное влияние не только на здоровье человека, но и всего живого на планете Земля. В России основным загрязнениям подвергаются почвы, а предпочтение отдается биологическим методам очистки почв от углеводородистых загрязнений с помощью препаратов-нефтедеструкторов как наиболее дешевых технологий. В связи с этим разработка технологии производства товарной формы препарата-нефтедеструктора «Родер» и изучение эффективности его применения является актуальным исследованием.

Большинство потребителей препаратов-нефтедеструкторов предпочитают иметь сухую форму (сухой порошок) препаратов, поскольку перевозить и хранить (1-2 года) такой препарат легче. В большинстве случаев сухую форму препарата получают методом распылительной сушки, а это негативно сказывается на жизнеспособности клеток и их нефтеокисляющей активности. Лиофильное высушивание клеток микроорганизмов для получения сухой формы препарата сохраняет до 90% их численность и нефтеокисляющую активность, но очень существенно удорожает препарат. Жидкие формы препаратов, как правило, имеют более высокую численность и активность живых клеток и более низкую стоимость, но такие препараты имеют ограниченный срок хранения (несколько месяцев).

Целью настоящего исследования было изучение зависимости от технологии выращивания биомассы штаммов препарата-нефтедеструктора «Родер» и

способа приготовления его товарной формы на базе ОАО «Биопрогресс» эффективности его действия на нефтяные загрязнения почв в различных регионах России.

Препарат-нефтедеструктор «Родер» был разработан для микробиологической очистки водной поверхности, почв и грунтов от загрязнений углеводородами нефти и нефтепродуктов. Состоит из двух выделенных из почвы, загрязненной сырой нефтью, высокоактивных штаммов-деструкторов нефти, непатогенных для людей, животных и растений, относящихся к роду Rhodococcus ( R. ruber Ac-1513 Д и R. erythropolis Ac-1514 Д) и обладающих синергизмом при деградации углеводородов нефти. Препарат разрешен для широкого применения в природе и успешно применялся для очистки водной поверхности, почв и грунтов от нефти и для очистки нефтешламов [1-4].

Культивирование штаммов родококков проводили в ОАО «Биопрогресс» в 600 л или 250 л ферментерах, оборудованных мешалками, подачей стерильного воздуха, контролем рН и температуры. Клеточную массу отделяли от культуральной жидкости центрифугированием на проточной центрифуге ОТР 101-К и высушивали на лиофильной сушилке марки ТГ-50 или методом распылительной сушки на сушилке марки NIRO ATOMAZER.

Микробиологические анализы. Определяли общую численность микроорганизмов (ОЧМ) на Пет-ри-филмз и количество УВ окисляющих (УВО) клеток в жидкой среде Раймонда с нефтью [5,6] в конце культивирования штаммов в ферментере и после приготовления из высушенных клеток препарата «Родер» или после смешивания сконцентрированных клеток штаммов препарата «Родер».

Химические анализы углеводородов (УВ) в почве до и после применения препарата «Родер» проводили гравиметрическим методом, методом колоночной хроматографии, ГХ и ВЭЖХ [7, 8]. Опре- деляли в пробах почв общую концентрацию веществ, экстрагируемых хлороформом (загрязнение), проводили фракционный анализ УВ в хлороформенных экстрактах на патронах Диапак С и анализ гексановых фракций УВ на газовом хроматографе и ВЭЖХ.

Каждый штамм, составляющий препарат «Ро-дер», выращивали отдельно в ферментере емко- стью 600 л на специально подобранной среде с учетом физиологических особенностей каждого из них. По окончании культивирования клеточную массу каждого штамма отделяли от культуральной жидкости и высушивали лиофильно. Затем штаммы проверяли на жизнеспособность и численность нефтеокисляющих клеток до и после высушивания. Жизнеспособность клеток родококков и их нефтеокисляющая активность сохраняются при этом на 90% и более (табл.).

Таблица. Численность нефтеокисляющих клеток (активность) штаммов препарата «Родер» и готовой формы препарата «Родер»

Лиофильное высушивание			Распылительная сушка			Жидкий концентрат
R. r, кл/мл	R. e кл/мл	Родер кл/г	R. r, кл/мл	R. e кл/мл	Родер кл/г	R. r, кл/мл	R. e кл/мл	Родер кл/мл
1*1010	1*109	7,5*109	1*109	1*1010	1,0*107	1*109	1*1010	1*1010

Прим.: R. r – штамм Rhodococcus rubber (Ас-1513 Д), R. e – штамм R. erythropolis (Ас-1514 Д)

Как видно из представленных результатов, численность и нефтеокисляющая активность до и после лиофильного высушивания клеток родококков препарата «Родер» различаются на 1 порядок и остаются достаточно высокими. После распылительной сушки теряется от 2 до 3-х порядков в численности УВО клеток (табл.). Самым мягким способом сохранения высокой численности и активности нефтеокисляющих клеток родококков, составляющих препарат «Родер», является получение концентрата этих клеток после выращивания в ферментере и стабилизации консервантом.

После высушивания клеток родококков методом распылительной или лиофильной сушки, сухие клетки штаммов смешивают в соотношении 1:1 и получают сухую форму препарата «Родер».

Препарат «Родер», полученный методом лиофильной сушки, применяли в пилотном эксперименте на почве, загрязненной мазутом на Обуховском заводе в Санкт-Петербурге. Результаты анализа почвы, загрязненной мазутом, в динамике применения препарата определяли после экстракции углеводородов из почвы и колоночной хроматографии хлороформенного экстракта гравиметрическим методом (рис. 1).

Под действием препарата «Родер» концентрация насыщенных углеводородов (УВ) в загрязнении снизилась на 92%, ароматических на 93%, смолисто-асфальтеновых на 92% за три обработки, проведенные в течение полутора месяцев летом 2006 г.

Исследование углеводородов (нефтепродуктов) загрязненной мазутом почвы до и после применения препарата «Родер» на газовом хроматографе представлено на рис. 2. Можно видеть, насколько эффективно клетки препарата деградировали мазутное загрязнение на Обуховском заводе в Санкт-Петербурге.

Исследование полиароматических углеводородов (ПАУ) на ВЭЖХ, извлеченных из загрязненной мазутом почвы, до и после применения препарата «Родер», представлены на рис. 3, где очень хорошо видно, что после применения препарата исчезли практически все ПАУ.

Рис. 1 . Деградация компонентов застарелого мазута в процессе биоремедиации загрязнения препаратом «Ро-дер» (участок № 1)

В соответствии с патентом РФ № 2295403, 2005 [9], посевной материал каждого штамма выращивали отдельно, затем засевали 250 л ферментер первым штаммом, а через 12 час подсевали второй штамм и заканчивали культивирование через 28 час после внесения второго штамма.

Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием, разводили остатком культуральной жидкости и вводили в распылительную сушилку.

Проверяли общую численность и численность нефтеокисляющих клеток до и после высушивания.

Результаты, представленные в таблице, показывают, что после распылительной сушки численность нефтеокисляющих клеток уже на 2-3 порядка ниже, чем при лиофильном высушивании.

Рис. 2. Газовая хроматограмма мазутного загрязнения в почве до (слева) и после действия препарата «Родер» (справа).

Рис. 3. ВЭЖ хроматограмма ароматической фракции до (красный цвет) и после (синий цвет) действия препарата «Родер» на загрязненную мазутом почву

Препарат «Родер», полученный методом распылительной сушки, проверяли в лабораторных условиях на минеральной почве, загрязненной нефтью. В каждую емкость (110*120 мм2) было внесено по весу 700 г загрязненной почвы. Исследовали в сравнении эффективность действия препарата «Ро-дер» как такового и гумата «Экстра» (производство Новосибирск) как такового, взятого в концентрации 0,1 г/кг почвы, а также действие препарата «Родер» в сочетании с гуматом, взятым в такой же концентрации. Негативный контроль – исходная почва, без внесения препаратов и удобрения. Результаты представлены на рис. 4 и 5.

На представленных хроматограммах (рис. 4) хорошо видно, что препарат «Родер» как таковой хорошо деградирует углеводороды нефтяного загрязнения, несколько хуже работает препарат в сочетании с гуматом. ГХ анализ в исходной почве обна-руживил 15 значимых пиков. После действия препарата «Родер» остается 3 пика (деградация 80%), а после совместного воздействия препарата и гумата 0,1г/кг почвы – 7 пиков (деградация 53%).

На рис. 5 представлены результаты фракционного анализа нефтяного загрязнения почвы до и после применения препарата «Родер», гумата и сочетания этого же препарата и гумата.

Под действием препарата «Родер» (трехкратная обработка) концентрация нефтяного загрязнения в почве снижается на 21,5%, под действием гумата 0,1г/кг – на 18,1%, а в сочетании «Родер»+гумат (0,1г/кг) на 25%.

Анализ ароматического загрязнения (ВЭЖХ) показал, что сочетание препарата и гумата не дало положительных результатов по биодеградации тяжелых ароматических углеводородов (ПАУ), что не подтверждает результаты, полученные нами раньше [10]. Возможно, это связано с тем, что раньше работали с гуматом Pow-humus (производство Германия).

Жидкую форму препарата «Родер» получали путем выращивания по отдельности штаммов препарата в 600 л ферментере, концентрирования клеток на центрифуге и смешивания в соотношении 1:1. Жизнеспособность и численность нефтеокисляющих клеток штаммов из ферментера и в готовом препарате выше, чем при любой сушке (табл.).

Жизнеспособность и нефтеокисляющая активность готового препарата «Родер» была высокой и сохранялась в готовом препарате «Родер» без изменения в течение 4-х месяцев.

Эффективность действия жидкого концентрата препарата «Родер» проверяли на загрязненном углеводородами грунте, взятом из промышленной зоны, в сравнении с препаратом Деворойл.

Технология обработки грунта была одинаковая: грунт изымали из загрязненного места, модифицировали, перемещали в смеситель и выдерживали при температуре 25оС и добавлении стимуляторов роста микроорганизмов при перемешивании в течение 72 час. Результаты представлены на рис. 7 и 8.

а                               б                                в

Рис. 4 . ГХ анализ исходного нефтяного загрязнения: (а) – негативный контроль, (б) после действия препарата «Родер, (в) после действия препарата «Родер» с гуматом 0,1 г/кг

Рис. 5. Деградация нефтяного загрязнения минеральной почвы под действием препарата «Родер» (слева), гумата 0,1 г/кг почвы (середина), сочетание препарата Родер и гумата 0,1

а                                 б                                 в                                   Рис.

6. ВЭЖХ анализ ароматической фракции нефтяного загрязнения почвы: (а) после действия препарата «Родер, (б) после действия гумата 0,1г/кг. (в) препарата «Родер» с гуматом 0,1 г/кг. Синий цвет – исходная почва, красный – по- сле действия препарата или гумата или их сочетания

ГХ анализ показал (рис. 7), что в исходной почве обнаруживаются 16 значимых пиков, суммарная высота пиков 19,349 мв. После действия препарата Деворойл обнаруживаются те же 16 пиков, но суммарная высота пиков на 6 мв меньше, а площадь пиков меньше на 0,1535 мв*мин, чем в исходной почве (деградация 30,6%).

После действия препарата «Родер» обнаруживается только один значимый пик с площадью в 0,369мв (деградация 98,9%).

а

б

в

Рис. 8 . ВЭЖХ анализ ароматической фракции (а) исходного нефтяного загрязнения, (б) под действием препарата Деворойл. (в) под действием препарата «Родер». Синий цвет – исходная почва, черный – свидетели (фенантрен, пирен, бензо(е)прирен); красный – после действия препарата

Под действием препарата «Родер» полиарома-тические УВ деградированы на 95,7%, под действием препарата Деворойл на 61,3%.

Таким образом, препарат «Родер» в виде жидкого концентрата обладал наилучшей нефтеокисляющей активностью и очень эффективно деградировал углеводородное загрязнение в почве. Следующим по эффективности и нефтеокисляющей активности был лиофильно высушенный препарат «Родер» и, наконец, препарат «Родер», полученный путем распылительной сушки оказался более низкого качества по всем трем критериям оценки.

• 1.    Мурыгина В.П., Аринбасаров М.У., Калюжный С.В . Очистка водной поверхности и грунтов от нефтяных загрязнений биопрепаратом Родер // ЭКиП, август, 1999 г. C. 17-19.

• 2.    Murygina V.P., Markarova M.Yu., Kalyuzhnyi S.V. Application of biopreparation "Rhoder" for remediation of oil polluted polar marshy wetlands in Komi Republic // Environmen International. 2005. N. 31. P. 163-166.

• 3.    Ouyang W., Liu H., Yu Y.-Y., Murygina V., Kalyuzhnyi S., Xu Z.-D - Huanjing Kexue . Field-scale study on performance comparison of bio-augmentation and compost treatment of oily sludge // Environmental Science. 2006. V. 27 (1). P. 160-164.

• 4.    Мурыгина В.П., Калюжный С.В. Биоремедиация загрязненных углеводородами территорий в северных регионах России // Мир нефтепродуктов. Вестник нефтяных компаний. 2008. № 4. С. 30-36.

• 5.    Назина Т.Н., Розанова Е.П. Химические и микробиологические методы исследования пластовых жидкостей и кернов / Препринт. Пущино, 1988. 25 с.

• 6.    Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Akademia, 2005. 603 с.

• 7.    Другов Ю.С., Зенкевич И.Г., Родин А.А . Газохроматографическая идентификация загрязнений воздуха, воды, почвы и биосферы. М.: Изд-во Бином, 2005. 752 с.

• 8.    Алексеенок Д.А., Герасимова Д.А., Михайлик Ю.В., Другов Ю.С., Зенкевич И.Г., Родин А.А. Определение бенз (а) пирена в почвах и грунтах методом ВЭЖХ с использованием концентрирующих патронов «Диапак С» (силикагель). 2009. lab@ecocity.ru

• 9.    Мурыгина В.П., Калюжный С.В., Войшвилло Н.Е . Способ получения бактериального препарата Родер для очистки почв, почвогрунтов, нефтешламов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов // Патент России No 2295403, 2007. Бюл. № 43.

• 10.    Salem K., Perminova I.V., Grechicheva N.U., Mecheriakov S.V . Influence of humic substances on degradation of oil by oiloxidizing. microorganisms // Biocatalytic Technology and Nanotechnology / Ed. G. Zaikov. N.Y.: Nova Science Publishers, 2004. P. 29-39.

TECHNOLOGY OF PRODUCTION OF THE COMMODITY FORM OF THE DRUGOILDESTRUCTOR «RODER» AND EFFICACY OF THE USE OF THESE FORMS IN LABORATORY CONDITIONS AND IN NATURE

S.N. Gaydamaka3, Yu.D. Frolov2

• ¹CJSC Bioprogress, Moscow region, Shchelkovo, Biocombinat

• ²AII-Russia Scientific-Research and Technology Institute of Biological Industry, Moscow region, Shchelkovo, Biocombinat