Технология производства и биокаталитические свойства протеолитического ферментного препарата

Особое внимание при гидролизе коллагенсодержащих белков в пищевой отрасли привлекает коллагеназа, позволяющая раскручивать тройные спирали коллагена и расщеплять пептидные цепи до небольших остатков – олигопептидов [1–3].

Сырьем для производства протеолитических ферментных препаратов, содержащих фермент коллагеназу, являются микроорганизмы (бактерии семейства Clostridium) и железы желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, внутренние органы рыбы, камчатского краба [4, 5]. Продуцентами коллагеназы являются патогенные микроорганизмы Clostridium histolyticum. Коллагеназы, полученные методом бактериального синтеза отличаются высокой специфичностью, повышенной каталитической способностью гидролизовать нативный, а также модифицированный коллаген [6, 7]. Выделяют следующие изоформы коллагеназы, соответствующие первому классу I (α, β, γ) и второму классу II (δ, ε, ζ). Следует отметить, что изоформы β и ζ отличаются высокой молекулярной массой, а изоформы α, γ, δ и ε имеют низкую молекулярную массу за счет усечения полипептидной цепи [8].

Согласно классификации, принятой Комитетом Международного союза биохимии и молекулярной биологии, коллагеназы, полученные бактериальным синтезом, относятся к семейству M9 подсемейства М9А и М9В типа М09.002 (коллагеназа I) и M09.003 (коллагеназа II) металлопептидаз MEROPS, родов Vibrio и Clostridium.– M9A и M9B. Такие коллагеназы имеют номер EC 3.4.24.3 [9].

Биосинтез коллагеназы проводят путем культивирования продуцентов на питательных средах, содержащих мясопептонный бульон, аминокислоты и другие вещества. Вместе с тем отмечается тенденция производ- ства коллагеназы путем культивирования микроорганизмов на растительных пептонах [10, 11].

Но вместе с тем, биосинтез коллагеназы бактериями рода Clostridium имеет недостаток - одновременно происходит синтез целого ряда протеолитических ферментов, в частности, клострипаин, эластаза, желатиназа и др., что не позволяет проводить эффективное получение заданного фермента [12]. Более того, клострипаин разрушает коллагеназу, так как она является для него субстратом [13].

При анализе рынка протеолитических ферментных препаратов, предназначенных для использования в биотехнологических, медицинских, ветеринарных и косметических целях, содержащих фермент коллагеназу, установлено, что в составе ферментных препаратов содержатся ферменты, продуцируемые бактериями рода Clostridium или содержащимися в пищеварительном тракте рыб и камчатского краба [14, 15].

В связи с этим целью исследования является разработка технологии получения протеолитического ферментного препарата на основе коллагеназы, выделенной из внутренностей рыбы и исследование биокаталитической активности в зависимости от рН и температуры.

Объекты и методы исследований

Протеолитическую активность (ПА) ферментного препарата определяли методом Ансона по ГОСТ 20264.2-88 рассчитывали по формуле, в качестве субстрата использовали коллаген, рН устанавливали с помощью фосфатно-буферного раствора, за единицу проте- олитической активности брали количество фермента, которое катализирует переход в не осаждаемый трихлоруксусной кислотой оса- док - количество субстрата, содержащее

1 мкмоль тирозина:

ПА =

cx Dx 10 О О

ТЭх 1 Охт '

где с - отношение объемов реакционной смеси и раствора ферментного препарата после добавления трихлоруксусной кислоты; D - оптическая плотность раствора; ТЭ - тирозиновый эквивалент, определяемый по калибровочной прямой (мкмоль/см3); 10 - продолжительность гидролиза (мин); m - масса ферментного препарата для реакции в 1 см3 раствора (мг); 1000 - коэффициент пересчета мг в г.

За 100 % активности исследуемого ферментного препарата брали максимальную определенную нами активность 543 ед./г.

Обработку сырья сверхвысоким давле- нием проводили с помощью гидростата, принципиальная схема которого представлена на рис. 1.

Установка для обработки рыбного сырья сверхвысоким давлением представляет собой рабочую камеру, заполненную жидкостью (дистиллированной водой и глицериновым маслом), которая является средой, передающей давление на продукт. Для создания давления используется мощный гидравлический насос. Рабочая камера выполнена из стали с толщиной стенок 5–10 см в зависимости от величины давления, которое создается в ней. В рабочую камеру вмонтирован клапан, через который выходит воздух при заполнении ка-

Рис. 1. Принципиальная схема установки для обработки сырья

меры продуктом и передаточной жидкостью. После того, как в камере давление достигло требуемой величины, начинается декомпрессия, путем открытия выпускного клапана. Пищевой продукт в рабочей камере равномерно обрабатывается сверхвысоким давлением со всех сторон. Для обработки сверхвысоким давлением следует отбирать сырье с высоким содержанием воды, в частности, органы пищеварительной системы рыбы. При обработке сырья сверхвысоким давлением отмечается некоторое повышение температуры, так как при возрастании давления совершается работа и, соответственно, происходит некоторое нагревание продукта, поэтому, в нашей технологии лучше использовать замороженное рыбной сырье.

Также при рассмотрении влияния сверхвысокого давления на сырье целесообразно рассмотреть возможность использования различных видов упаковки.

К упаковке предъявляются следующие требования:

– не должна иметь незаполненных пространств или содержать воздух (необходимо упаковывать в вакуумной машине);

– упаковочный материал должен быть прочным, гибким, обладать обратимой деформацией и быть без структурных повреждений.

Экстракцию и гомогенизацию рыбного сырья, обработанного сверхвысоким давлением, осуществляли в универсальной синхронно-смесительной установке на кафедре пищевой инженерии Уральского государственного экономического университета. Используемая установка предназначена для выполнения комплексных задач по смешиванию, эмульгированию, охлаждению, пастеризации (рис. 2).

Экстракцию и гомогенизацию проводили в изотоническом растворе в соотношении 1:3 при температуре 35–37 °С в течение 3–4 часов с частотой вращения лопастей 100–200 оборотов в минуту. Температуру задавали с помощью блока управления, регулирующего работу компрессора, входящего в комплексную синхронно-смесительную установку. При нормальном режиме работы происходит циклический опрос всех датчиков, подключенных к системе, все данные передаются на компьютер, подключенному к устройству. На дисплей выводится текущая температура. Температура сырья устанавливается с помощью кнопки «Охлаждение» на блоке управления, или «Нагрев» в ручном режиме, или с помощью установленной на компьютере программы. Процесс смешивания также аналогично контролируется с помощью компьютерной программы и кнопки «Смеситель», которая включает соответствующее устройство, состояние каждого исполнительного элемента индицируется соответствующим светодиодом и индикатором дисплея. Работа всех кнопок дублируется на компьютере. С помощью режима «Редактирование настроек» устанавливается необходимая температуру смешивания и частота вращения лопастей в смесителе.

Рис. 2. Универсальная синхронносмесительная установка

Процесс ультрафильтрации проводили в лабораторных условиях на установке, представленной на рис. 3.

Установка ультрафильтрации состоит из следующих основных узлов и элементов. Циркуляционный бак 1 объемом 50 литров предназначен для загрузки исходного ферментного раствора и слива готового продукта после ультрафильтрации. Милливольтметр 2 необходим для наблюдения за температурой раствора в процессе ультрафильтрации посредством контроля электродвижущей силы, наводимой в соединенной с ним термопаре 6 типа «хромель-алюмель». Для компенсации влияния температуры окружающей среды использован классический сосуд Дьюара 3 в виде герметич-

Рис. 3. Схема установки для получения раствора ферментного препарата методом ультрафильтрации: 1– бак для исходного раствора/готового концентрата; 2 – милливольтметр; 3 – сосуд Дьюара; 4 – регулировочный вентиль; 5, 10 – вентили; 6 – термопара; 7 – сосуд для отвода пермеата; 8 – манометр с разделителем; 9 – ультрафильтрационная ячейка; 11 – ротаметр; 12 – насос; 13 – змеевик

ной емкости из пенопласта с помещенным вовнутрь льдом. Регулировочный вентиль 4 предназначен для управления давлением внутри контура при работе установки. Вентили 5 и 10 предназначены для герметичного отключения части контура системы при сборке и разборке ультрафильтрационной ячейки 9. Сосуд 7 предназначен для отвода пермеата в процессе получения ферментного препарата. Ротаметр 11 предназначен для определения расхода исходного раствора сырья. Центробежный насос 12 служит для создания давления в контуре и обеспечивает необходимую для ультрафильтрации скорость потока ферментного препарата. Змеевик 13 служит для изменения температуры раствора в процессе работы установки с помощью подачи через него воды заранее известной температуры.

Все металлические детали установки, контактирующие с раствором, выполнены из нержавеющей стали 12Х18Н10Т. Основным рабочим элементом установки является ультрафильтрационная ячейка 9. Она представляет собой цилиндр длиной 900 миллиметров, в который помещаются керамические мембраны КУФЭ длиной 800 миллиметров с размером пор 21 кДа, изготовленные из диоксида титана анатазной модификации с напыленным селективным слоем α-оксида алюминия.

Работа установки заключается в разделении исходного раствора, поданного в циркуляционный бак, на ферментный препарат и водный раствор, непрерывно отводящийся из аппарата.

Результаты и их обсуждение

Разработана технология получения ферментного препарата:

– выделение внутренностей кеты;

– обработка сверхвысоким давлением 100–200 МПа в течение 60 с;

– измельчение до частиц 500–600 мкм;

– экстракция и гомогенизация в изотоническом растворе в соотношении 1:3 при температуре 35–37 °С в течение 3–4 часов с частотой вращения 100–200 оборотов в минуту;

– центрифугирование (3000 об./мин);

• –    ультрафильтрация через керамические мембраны с лимитом пропускания до 21 кДа;

• –    упаковка в полиэтиленовые пакеты емкостью 50 мл;

• –    стерилизация сверхвысоким давлением в 300 МПа в течение 60–120 с.

В технологии получения ферментного препарата использован процесс гомогенизации, позволяющий в результате механического воздействия разрушить лизосомы клеток внутренних органов рыбы, где локализуются протеолитические ферменты в неактивной форме (иначе активные ферменты гидролизовали бы клетки рыбы), следует отметить, что предварительное измельчение внутренних органов рыбы увеличивает скорость экстракции ферментов в раствор, что согласуется с результатами исследований [16].

Используемая нами мембранная ультрафильтрация гомогенизата внутренних органов кеты позволяет удалить из раствора нерастворимые липидно-белковые комплексы с большой молекулярной массой, что согласуется с исследованиями [17].

Предложенная технология выделения фермента из отходов рыбного сырья (внутренностей) будет экономически целесообразной по сравнению с ферментами микробного синтеза, в частности, микробной коллагеназой, так как источник сырья – отходы рыбной промышленности достаточно доступны и дешевы, что согласуется с результатами исследований [18]. Обработка полученного ферментного препарата сверхвысоким давлением позволяет увеличить его стабильность при хранении, путем бактерицидного действия на микрофлору, что доказано в исследованиях [19] по обработке животного сырья высоким давлением в сочетании с активной упаковкой на основе эфирного масла. Установленный автором [20] синергетический эффект применяемых воздействий способствует снижению количества L. monocytogenes ниже предела обнаружения в течение 60 суток хранения при низких положительных температурах (от 0 до 4 °С). Однако при повышении температуры хранения до 8 °С рост L. monocytogenes возобновлялся. Следовательно, полученный ферментный препарат следует хранить при низких положительных температурах – менее 4 °С. Об эффективности обработки высоким давлением в отношении снижения общего количества аэробных и молочнокислых бактерий в сырье животного происхождения сообщается в работе [21].

На рис. 4 представлено влияние рН на активность фермента ферментного препарата при температуре 40 ° С.

Из рис. 4 следует, что активность ферментного препарата зависит от рН и максимальная активность (100 %) при рН на уровне 8. Сдвиг рН в щелочную сторону приводит к снижению активности. Так, активность ферментного препарата при рН 10 составляет 89 %. Оптимум активности образцов ферментного препарата наблюдается при рН от 7 до 9.

На рис. 5 представлено влияние температуры на активность ферментного препарата при установленном нами оптимуме рН 8.

Рис. 4. Влияние рН на активность ферментного препарата при температуре 40 °С, %

ферментный препарат

Рис. 5. Влияние температуры на ферментный препарат при оптимуме рН 8

ферментный препарат

Повышение температуры до определенных пределов увеличивает скорость любой химической реакции, так как с повышением температуры увеличивается скорость движения молекул и, соответственно, взаимодействие химических веществ, ускоряется скорость реакции. Но для реакции с участием фермента-катализатора характерен температурный оптимум, при превышении которого происходит денатурация активного центра фермента. Установлено, что оптимум каталитической активности ферментного препарата находится при температурном режиме от 37 до 42 ° С. Результаты исследований согласуются с данными [21, 22] по аналогичному влиянию рН и температуры на протеолитическую активность ферментного препарата, сходного по эффективности с коллагеназой и имеющего полный набор протеиногенных аминокислот с преобладанием аспаргина и глютамина.

Выводы

Разработана технология производства ферментного препарата из рыбного сырья, включающая обработку органов пищеварительной системы рыбы кеты сверхвысоким давлением 100–200 МПа в течение 60 с, измельчение сырья с последующей экстракцией и гомогенизацией в изотоническом соотношении 1:3 при температуре 35–37 °С в течение 3–4 часов с частотой вращения 100–200 оборотов минуту, центрифугирование ультрафильтрации через керамические мембраны с лимитом пропускания до 21 кДа, упаковка в полиэтиленовые пакеты емкостью 50 мл и стерилизация сверхвысоким давлением. При производстве ферментного препарата по указанной технологии с целью недопущения инактивации фермента проводится контроль температурного режима при гомогенизации с помощью установления необходимой температуры, регулирующей работу компрессора с охлаждающей жидкостью. Используемая технология ультрафильтрации гомогенизата заключается в разделении исходного раствора, поданного в циркуляционный бак, на ферментный препарат и водный раствор, непрерывно отводящийся из аппарата. При ультрафильтрации гомогенизата регуляции температуры использован классический сосуд Дьюара в виде герметичной емкости из пенопласта с помещенным вовнутрь льдом. В результате исследований установлено влияние рН и температуры на биокаталитическую активность ферментного препарата. Определен оптимум рН (7–9) активности ферментного препарата. Сдвиг рН в щелочную сторону приводит к снижению активности. Установлено, что оптимум каталитической активности ферментного препарата находится при температурном режиме от 37 до 42 °С.