Технология создания биологически активных добавок для животноводства

санитарно - микробиологических , органолептических показателей готового корма .

Основой субстрата для новых штаммов микроорганизмов , проявляющих целлюлолитическую активность , является солома гречихи . Солома гречихи характеризуется сочетанием в своем составе белков , крахмала , сахарозы , клетчатки , жира , аминокислот , минеральных солей , витаминов и микроэлементов ( Скорина , Е . Д , 2007), ценных органических веществ не волокнистого характера – группы флавоноидов ( рутин , кварцетин , липиды , полисахариды и др .), которые проявляют биологически активные свойства и угнетают развитие патогенной микрофлоры ( Стейнифорт , А . Р .,1983).

Биоконверсия отходов возделывания, производства и переработки гречихи в биотехнологические продукты является одной из важнейших целей сохранения благоприятной экологической ситуации.

Масштабы ежегодного образования отходов только в Орловской области РФ характеризуются величиной более 1,5 млн . тонн . Только пожнивные остатки гречишной соломы составляют 18 тыс . т , из них можно получить 2 т биофлавоноидов , включая витамин рутин ; 20 тыс . т белково - углеводных кормовых добавок для животноводства с содержанием белка 58-60%; 10 тыс . т биоудобрений с содержанием макроэлементов K, Ca, Mg и микроэлементов Br, Ba,Co и прочих полезных продуктов .

Помимо этого , за короткий период вегетации гречиха способна образовывать большую вегетативную массу . За 40-50 дней один гектар гречихи может произвести до 150-300 ц зеленой массы , из которой получают ценнейшие компоненты : витамины , микроэлементы , биофлавоноиды , лекарственные препараты , красители , антиоксиданты , пищевые волокна и другие продукты . Например , за год с 1 га можно получить от 300 до 600 кг рутина – витамина , обладающего капиляроукрепляющим и радиопротекторным свойствами и до 2 т биофлавоноидов ( БФ ) при норме высева семян 3,5 млн . шт . Диапазон терапевтического применения биофлавоноидов очень широк , но один из основных биологических эффектов БФ обусловлен их антиоксидантными свойствами . Антиоксидантное действие БФ связывают с их способностью акцентировать свободные радикалы и хелатировать ионы металлов , катализирующих процессы окисления .

Биотехнологические методы переработки продуктов производства гречихи путем микробиологического синтеза способствуют созданию экологически чистых безотходных производств и получению перспективного сырья для пищевой промышленности , кормопроизводства и сельского хозяйства .

Целью настоящего исследования является разработка режимов гетерофазного глубинного культивирования разных штаммов дрожжей (Candida tropicalis, промышленных штаммов микроорганизмов N.V. EP 317/402 lactobacillus acidophilus, E. С oli, гриба

Trichoderma viride на рассматриваемых ферментативных гидролизатах с использованием отходов сахароперерабатывающих предприятий ( шрота , мелассы , утфеля ) для получения белково - углеводных продуктов с более высоким содержанием « сырого » протеина ( до 40%), биофлаваноидов и пр .

Материалы и методы исследования

В ходе эксперимента были использованы промышленные штаммы микроорганизмов N.V. EP 317/402 lactobacillus acidophilus, E. С oli, гриба Trichoderma viride. Переработку растительного сырья осуществляли в центре сельскохозяйственной биотехнологии Орловского государственного аграрного университета на лабораторном ферментере Biostat A plus. При исследовании влияния субстрата при культивировании штамма бактерий lactobacillus acidophilus на физико - химические показатели культуральной жидкости и продуктов на ее основе , был произведен подбор компонентов в двух вариантах : вариант 1: солома гречихи , свекловичный жом , меласса , в пропорции 1:1:1. Культивирование осуществлялось в течение 3 суток ; вариант 2: солома гречихи , свекловичный жом , утфель первого продукта 1:5:2. Предварительно из соломы гречихи была выделена фенольная фракция , которая обладает антиоксидантным эффектом и используется в качестве БАД к пище . При исследовании влияния субстрата при культивировании штамма бактерий E. С oli в качестве углеводсодержащих субстратов были использованы отходы возделывания гречихи и сахарной свеклы : вариант 3: цветки гречихи , мучка гречневая , утфель 1- го продукта , заменитель цельного молока на соевой основе ( ЗЦМ ) – 5:1:1:0,5, вариант 4 : солома гречихи , предварительно обработанная .

Результаты и их обсуждение

В отработанной массе прошедшей экстракцию соломы гречихи остается значительное количество ценных органических компонентов . После выделения компонентов не волокнистого характера ( флавоноидов ), основную ценность представляет углеводный комплекс для культивирования N.V. EP 317/402 lactobacillus acidophilus, E. C oli, гриба Trichoderma viride . ( табл . 1).

Таблица 1 – Органические компоненты отходов производства гречихи

Отходы производства гречихи	« Сырой » протеин , %	« Сырой » жир , %	« Сырая » клетчатка , %	« Сырая » зола , %	БЭВ , %	Флавоноиды , г / л
Солома после водной экстракции флавоноидов	2,54	1,7	45,78	6,0	43,98	0,3

Биофлавоноиды в твердой фазе после водной экстракции соломы гречихи (0,3 г / л ) могут служить дополнительным природным источником углерода при дальнейшей биоконверсии полученной массы при помощи микробного синтеза , так как в отходе содержится значительное количество ценных органических компонентов (« сырой » клетчатки -45,78 %, БЭВ - 43,98%). Клетчатка в ее естественной ассоциации с лигнином является наиболее распространенным органическим веществом для биологической конверсии растительного сырья . Именно клетчатка должна рассматриваться в качестве 30

основного питательного сырья для биотехнологического процесса получения белково - углеводного продукта ( Егорова , Т . А . и др ., 2005).

Снижение количества грубой клетчатки - отхода от производства флавоноидов из соломы гречихи можно осуществлять путем термохимического и ферментативного гидролиза до простых водорастворимых сахаров ( по выходу редуцирующих веществ ), которые затем легко подвергаются ферментации микроорганизмами с образованием одноклеточного белка и многих других ценных продуктов .

Термообработка субстрата вызывает ряд химических реакций , снижающих его селективность . Во - первых , происходит термический гидролиз полисахаридов и высвобождение легкодоступных сахаров , служащих хорошим питанием для микроорганизмов . Во - вторых , происходит делигнификация лигноцеллюлозного комплекса субстрата . В результате , целлюлоза и гемицеллюлоза становятся доступными для микромицетов , обладающих целлюлазной активностью ( Синицын , А . П . и др ., 1984). При термореагентной обработке субстрата определяли влияние таких параметров , как температура , рН , давление и время воздействия на выход редуцирующих веществ . Результаты исследований показали , что при давлении 0,5 атм ., t=110 ^оС и экспозиции 30 мин . наибольший выход редуцирующих веществ ( РВ ) – 4,1 г / л достигался при рН =3. Так как данная концентрация РВ не может обеспечить высокий уровень обогащения белком продукта при ферментации дрожжей , дальнейшей задачей наших исследований являлось изучение возможности ферментативного гидролиза субстрата .

При ферментативном гидролизе РВ появляются в результате гидролиза некрахмальных полисахаридов клеточных стенок растительного сырья . В качестве источника целлюлазы использовали активный разрушитель полисахаридов – микромицет Trichoderma (Алимова Ф.К.и др., 2007.). Лигноцеллюлозный материал является для гриба дополнительным источником углерода. Посевной материал микромицета вносили в количестве 1% к объему отхода от экстракции соломы гречихи и культивировали в биореакторе BIOSTAT A plus при оптимальных условиях действия целлюлаз – рН=5,5, t-50оС, 200 об/мин. Эффективность процесса ферментации определяли по накоплению РВ. Максимум ферментативной активности (рис. 1.) приходится на 3-4 сутки культивирования гриба. Выход РВ в ферментативном гидролизате составил 14,13 г/л.

Рисунок 1 – Динамика ферментативной активности Trichoderma по накоплению редуцирующих веществ

Вместе с тем , в течение трех суток осуществлялось культивирование микроорганизмов Lactobacillus acidophilus штамма n.v. ЕР 317/402 « Наринэ ». У данного штамма обнаружено повышенное содержание ароматических веществ - до 6,9 мг %, аминокислот - до 23 мг %, аскорбиновой кислоты - до 1,20 мг %, рибофлавина - до 1680 мг %.

Для повышения кинетики скорости роста изучаемого штамма осуществлен оптимальный подбор компонентов субстрата для получения БАВ : вариант 1: солома , свекловичный жом , меласса , в пропорции 1:1:1; вариант 2: солома , свекловичный жом , утфель первого продукта 1:5:2.

В процессе ферментирования были определены физико - химические показатели культуральной жидкости ( табл . 2).

Таблица 2 – Физико - химические показатели культуральной жидкости с N.V. EP 317/402 lactobacillus acid.

Показатели	Нулевая установка		1 сутки		2 сутки		3 сутки
	№ 1	№ 2	№ 1	№ 2	№ 1	№ 2	№ 1	№ 2
nD	1,343 67	1,335 3	1,343 77	1,336 3	1,343 78	1,336 7	1,336 88	1,33 68
Сухое вещество , %	7,31	2,45	7,40	2,51	7,42	2,56	7,49	2,57
Сахара ( по сахарозе ), %	–	2,1	–	2,3	–	2,65	–	2,5
Белок , %	0,12	0,09	1,84	0,15	2,15	0,68	4,25	2,45
Вит . C, %	0,00	0,00	0,05	0,06	0,06	0,07	0,06	0,07

В процессе культивирования происходит накопление сухих веществ в культуральной жидкости в 4 раза .

Из культуральной жидкости получена биологически активная добавка с высоким содержанием белка и витаминов ( табл . 3).

Таблица 3 – Состав БАВ ( на сухое вещество ) в зависимости от субстрата культивирования Lactobacillus acidophilus штамма n.v. ЕР 317/402 « Наринэ »

Показатель	Вариант
	№ 1	№ 2
Белок , %	56,74	95,3
Витамин С , %	0,8	1,5
Рибофлавин , %	1,1	2,2

При использовании штамма бактерий E. Coli в 3 и 4 вариантах закисление происходит медленно, а накопление сухих веществ быстро, что позволяет сохранить функциональные и питательные свойства кормовой добавки (рис. 2).

□ рН нач □ рН кон

Рисунок 2 – Динамика изменчивости водородного показателя в зависимости от субстрата : 3- цветки гречихи : мука гречневая : утфель 1- го продукта : заменитель цельного молока ( ЗЦМ )-5:1:1:0,5; 4- солома гречихи , предварительно обработанная .

Содержание растворимых сухих веществ зависит не только от выбранного субстрата и культивированного на нем микроорганизма , но и от химического состава и формы находящихся в нем веществ .

Таким образом , полученные данные указывают на возможность использования изучаемых микроорганизмов и гриба Trichoderma в биоконверсии отходов . Так , грибы рода Trichoderma, потребляющих негидролизованные полисахариды , после предварительного термогидролиза субстрата можно использовать в качестве продуцента белка . С целью получения белково - углеводного продукта перспективно гетерофазное глубинное культивирование дрожжей lactobacillus acidophilus на ферментативных гидролизатах отхода от производства флавоноидов соломы гречихи . Максимум ферментативной активности в среде является оптимальным временем для инокуляции .

Для получения биотехнологических продуктов и переработки отходов производства сахарной промышленности и пожнивных остатков сельскохозяйственных культур перспективно использование E. Coli.