Temperature stress and consequences of its influence on functional activity of mitochondria in maize etiolated seedlings

В жизни любого организма, а особенно растений, температура окружающей среды является одним из основных факторов, определяющих его существование. Изменение температуры ведет к самым разнообразным и часто неблагоприятным последствиям. Одним из таких последствий является развитие окислительного стресса, связанного с избыточной генерацией активных форм кислорода (АФК). Показано усиление образования АФК при повышении температуры в культурах клеток табака, арабидопсиса и озимой пшеницы (Volkov et al., 2006; Lokato et al., 2008; Fedyaeva et al., 2014). Увеличение содержания АФК и продуктов перекисного окисления липидов происходит и при действии на растения низких температур (Suzuki, Mittler, 2006; Xu et al., 2013; Grabel’nykh et al., 2014; Lyubushkina et al., 2014). Избыточная генерация АФК в клетках растений может приводить к дисфункции митохондрий и гибели клеток (Marchi et al., 2012; Weir et al., 2003). В то же время митохондрии сами являются источником АФК (Møller, 2001, 2007; Schwarzlander, Finkemeir, 2013). В нефотосинтезирующих частях растений митохондрии и их электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) вносят основной вклад в продукцию АФК в клетке (Møller, 2001, 2007). На культуре клеток и этиолированных проростках растений показано, что митохондрии являются основным источником генерации АФК в них при тепловом и холодовом шоке (Vacca et al., 2004; Grabel’nykh et al., 2014; Fedyaeva et al., 2014; Lyubushkina et al., 2014). АФК, образующиеся в митохондриях, могут выступать в качестве сигнальных молекул, участвующих в передаче внутриклеточных сигналов, регуляции экспрессии генов и активации защитных систем клетки или запуске программ клеточной гибели (Gray et al., 2004; Rhoads et al., 2006; Volkov et al., 2006).

Регуляция функционирования митохондрий важна для поддержания клеточного гомеостаза в клетках растений при стрессе (Schwarzlander, Finkemeir, 2013). В условиях стресса возрастает потребность в энергии для поддержания целостности и функциональной активности внутриклеточных структур, поэтому сохранение сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях необходимо для развития адаптивных реакций. Ранее изучалась энергетическая активность митохондрий кукурузы под действием повышенных температур на побеги и культуру клеток (Pobezhimova et al. , 1990; Varakina et al. , 1991). Было установлено, что действие температур 36, 41 и 46 °С в течение 3 ч не приводит к изменению энергетической активности митохондрий, а температура 51 °С вызывает резкое снижение скорости дыхания митохондрий. Происходит ли при этом генерация в митохондриях АФК и, какие комплексы ЭТЦ в большей степени задействованы в этом процессе, неизвестно.

Одним из ферментов, участвующих в детоксикации АФК в стрессовых условиях, является пероксидаза. Пероксидазы (ЕС 1.11.1.7) относятся к оксидоредуктазам с широким спектром субстратов (Zaharova et al., 2011), и катализируют большинство реакций, протекающих во всех типах тканей и органелл живых организмов, включая окислительно-восстановительные реакции фотосинтетического аппарата растительных клеток и энергетического обмена митохондрий (Andreeva, 1988). Наличие множества изоформ этого фермента, кодируемых разными участками генома, позволяет ей быть как ткане- так и органелл-специфичным ферментом (Andreeva, 1988; Davydova et al., 1998). Благодаря своей выраженной функциональной значимости для растительного организма и его тонкой генетической и метаболической регуляции (Andreeva, 1988), этот фермент способен быстро реагировать на внешние воздействия и активно участвовать в быстром ответе на стресс и в формировании длительной адаптации. Пероксидазу также отличает высокая термостабильность (Müftügil, 1985; Thongsook, Barrett, 2005; Fedulov et al., 2006) и способность долго сохранять функциональность вне живого организма (Andreeva, 1988).

Целью работы явилось изучение влияния флуктуации температуры среды (низкие – фоновые – высокие температуры) на активность пероксидазы в побегах кукурузы, выживаемость побегов и функциональную активность изолированных из них митохондрий.

MATERIALS AND METHODS

В работе использовали этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L., гибрид Катерина СВ), выращенные на влажной фильтровальной бумаге при 27°С в темноте в течение 4 суток. Побеги проростков в возрасте 4-х суток срезали и помещали в стакан с водой с температурой 0, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47 или 52 °С в инкубатор на 30 мин. После обработки одну часть побегов оставляли на отрастание при температуре 27°С для определения их жизнеспособности, а другую часть использовали для определения общей активности пероксидазы и выделения митохондрий.

Жизнеспособность побегов кукурузы определяли по их отрастанию через 5 суток после действия температуры. Количество выживших побегов оценивали в процентах от общего числа побегов.

Выделение и определение общей активности гваякол-пероксидазы осуществляли по стандартной методике как описано в работе (Romanova et al. , 2013).

Митохондрии выделяли из побегов проростков с помощью дифференциального центрифугирования по ранее опубликованной методике (Grabel’nykh et al. , 2011).

Общее содержание АФК в изолированных митохондриях определяли с использованием 1 мкМ 2’,7’-дихлорофлуоресцеин диацетата (H2DCF-DA) по методике, опубликованной ранее (Korsukova et al., 2013). Флуоресценцию DCF измеряли на спектрофлуорофотометре RF-5301PC (SHIMADZU, Япония). Для возбуждения флуоресценции DCF использовали свет с длиной волны 480 нм, испускание регистрировали при длине волны 524 нм.

Скорости поглощения кислорода митохондриями определяли с использованием кислородного электрода Кларка и полярографа Oxytherm system (“Hansatech Inst.”, Англия) в ячейке объемом 1,4 мл при 26 °С. Реакционная среда содержала 18 мМ КН 2 РО 4 , 125 мМ КСl, 1 мМ МgСl 2 , 5 мМ ЭДТА, рН 7,4. В качестве субстрата окисления использовали 8 мМ сукцинат в присутствии 5 мМ глутамата и 3 мкМ ротенона. Рассчитывали скорость окисления сукцината в состоянии 3 (V 3 ) – скорость поглощения кислорода при фосфорилировании АДФ; состоянии 4 (V 4 ) -скорость поглощения кислорода после истощения АДФ; дыхательный контроль по Чансу и Вильямсу (ДК=V 3 /V 4 ) (Еstabrook, 1967). Максимальную скорость окисления сукцината измеряли в присутствии 100-200 мкМ АДФ.

Интактность внешней мембраны митохондрий рассчитывали по скорости аскорбат-зависимого стимулируемого цитохромом с KCN-чувствительного поглощения кислорода в отсутствие и в присутствии 0,04% Тритона Х-100 (Grabel’nykh et al. , 2014). Концентрацию митохондриального белка определяли согласно методу Лоури (Lowry et al. , 1951).

Представлены средние арифметические значения и их стандартные отклонения.

RESULTS AND DISCUSSION

Из рис. 1 видно, что флуктуации температуры среды приводят к изменению активности гваякол-зависимой пероксидазы в тканях побегов кукурузы, при этом наблюдается два пика ее активности, один с максимумом при 17 °С, другой при 37 °С (рис. 1). Следует рассмотреть по отдельности действие повышенных и пониженных температур на активность пероксидазы в тканях побегов кукурузы. В диапазоне повышенных температур 32 – 42 °С происходило значительное увеличение активности данного фермента с максимумом при 37 °С, когда активность пероксидазы была на 63% выше по сравнению с контролем (рис. 1). При дальнейшем повышении температуры до 47 °С увеличение активности пероксидазы не было таким значимым, а повышение температуры воздействия до 52 °С приводило к угнетению активности фермента, которое составило 27% (рис. 1). В отличие от действия повышенных температур, на которые пероксидаза реагировала более выражено, понижение температуры среды на 5 °С – до 22 °С не сопровождалось достоверным изменением активности фермента (рис. 1). Увеличение активности пероксидазы происходило только после действия на побеги температуры 17 °С (на 35% по сравнению с контролем), а при 0 °С активность пероксидазы также не отличалась от ее активности при контрольной температуре (27 °С) (рис. 1).

Анализ выживаемости побегов кукурузы, подвергнутых температурной обработке, выявил, что в диапазоне температур 17 – 37 °С их жизнеспособность не изменяется или изменяется незначительно (рис. 2). В то же время повышение температуры воздействия до 42 °С приводило к гибели 30% проростков, температура 47 °С вызывала гибель 70% проростков, а температура 52 °С – гибель всех проростков (рис. 2). Охлаждение побегов кукурузы до 0 °С не сопровождалось значительным снижением выживаемости (рис. 2). Существует предположение,        что         генетически детерминированная устойчивость к стрессам коррелирует с уровнем антиоксидантной активности или способности клеток нарастить антиоксидантный потенциал (Polesskaya, 2007). Данные по изменению выживаемости побегов кукурузы после действия повышенных и пониженных температур согласуются с данными по изменению активности пероксидазы в тканях побегов кукурузы и свидетельствуют в пользу защитной роли этого антиоксидантного фермента при температурном стрессе.

Митохондрии растений являются источником образования АФК, при этом в генерации АФК принимают участие комплексы I, II и III ЭТЦ (Møller, 2001; Gleason et al., 2011). В зависимости от температурной обработки побегов было различным содержание АФК в изолированных из них митохондриях (рис. 3). После действия повышенных (37 и 42 °С) и пониженных (22, 17 и 0 °С) температур на побеги кукурузы наблюдали повышение содержания АФК в митохондриях (рис. 3). Наибольшее увеличение содержания АФК отмечали в митохондриях, изолированных из побегов, подвергнутых обработке температурами 37 °С (77%-ое увеличение), 42 °С (86%-ое увеличение), 17 °С (112%-ое увеличение) и 0 °С (84%-ое увеличение) (рис. 3). Отсутствие значимых изменений в содержании АФК в митохондриях кукурузы из побегов, подвергнутых воздействию температур 47 и 52 °С, может отчасти объясняться ингибированием активности ферментов эстераз, необходимых для отщепления диацетатного остатка от H2DCF-DA (Maxwell et al., 1999).

Повышенное содержание АФК в митохондриях в результате действия на побеги кукурузы пониженных температур (0, 17 и 22 °С), возможно, явилось одной из причин нарушения интактности мембран митохондрий (рис. 4), их окислительной и фосфорилирующей активности (рис. 5). В то же время при снижении температуры обработки побегов с 27 °С (температура выращивания кукурузы) до 22, 17 и, особенно 0 °С, в митохондриях возрастало цианид-резистентное дыхание, связанное с активацией альтернативной оксидазы (не показано). Если при температуре 27 °С цианид-резистентное дыхание в митохондриях составляло около 8%, то при понижении температуры до 22, 17 и 0 °С оно возрастало до 12, 16 и 21%, соответственно.

Анализ окислительной активности митохондрий кукурузы выявил, что все изученные в работе температуры в той или иной степени вызывают снижение скорости окисления субстрата – сукцината (рис. 5а). Наряду со снижением скорости окисления сукцината митохондриями воздействие повышенных температур 42-52 °С приводило к снижению степени сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях, о чем свидетельствует падение коэффициента ДК (рис. 5б). Значительное ингибирование скорости окисления сукцината митохондриями при 52 °С сопровождалось отсутствием перехода митохондрий в состояние дыхательного контроля (рис. 5б). Интерес представляют данные по некоторой стимуляции скорости фосфорилирующего дыхания митохондрий кукурузы при температуре 37 °С, по сравнению с температурой 32 °С, и связанное с этим возрастание коэффициента ДК (рис. 5).

Температура, °C

Figure 1. Активность гваякол-зависимой пероксидазы в побегах кукурузы, подвергнутых 30-минутной температурной обработке. n=18. M±S.D.

Figure 2. Выживаемость побегов кукурузы, подвергнутых 30-минутной температурной обработке.

n=30. M±S.D.

Q

го

ф о ф Q

О

Ф

I— 5

е

о

500 -|

450 -

400 -

350 -

300 -

250 -

200 -

150 -

100 -

50 -О -

0   17   22   27   32   37   42   47   52

Температура, °C

• Figure 3.    Содержание АФК в митохондриях, изолированных из побегов кукурузы, подвергнутых 30-минутной температурной обработке. n=6. M±S.D.

  
  
  

Температура, °C

• Figure 4.    Интактность внешней мембраны митохондрий, изолированных из побегов кукурузы подвергнутых 30-минутной температурной обработке. n=3. M±S.D.

  
  
  
  
  
  

Температура, °C

Figure 5. Скорость окисления сукцината ( а ) и коэффициент ДК ( б ) в митохондриях, изолированных из побегов кукурузы, подвергнутых 30-минутной температурной обработке. n=3-4. M±S.D.

Обозначения: V 3 – скорость фосфорилирующего дыхания (состояние 3), V 4 – скорость нефосфорилирующего дыхания (состояние 4), коэффициент ДК – коэффициент дыхательного контроля по Чансу и Вильямсу (V 3 /V 4 ).

Таким образом, в этиолированных побегах кукурузы выявлены закономерности изменения активности антиоксидантного фермента -пероксидазы и функциональной активности митохондрий при действии повышенных и пониженных температур. Известно, что слабое внешнее воздействие на организм, расположенное в зоне его экологической толерантности, оказывает стимулирующий и адаптирующий эффект, а более сильное воздействие приводит к угнетению жизненных функций организма. Кукуруза является теплолюбивым растением, при воздействии температур в диапазоне 32-42 °С у проростков кукурузы включаются адаптационные механизмы, о чем свидетельствует возрастающая активность пероксидазы, в отличие от действия повреждающей температуры 52 °С, когда активность фермента снижается. Известно, что для кукурузы температуры 32-47 °С относятся к закаливающим, а температура 52 °С – повреждающей; температуры 17-27 °С относятся к фоновым, а температура 0 °С – повреждающей (Titov et al., 2006). Повреждение побегов кукурузы при температуре 42 и 47 °С и отсутствие значимого повреждения при температуре 0 °С (рис. 2) вероятно объясняется тем, что используемый в нашей работе гибрид кукурузы является холодостойким, поэтому температурные границы зон теплового и холодового закаливания у него смещены.

В этиолированных тканях митохондрии являются основным источником АФК (Møller, 2001). Можно предположить, что образующиеся в митохондриях АФК могут выполнять сигнальную функцию и приводить к усилению синтеза белков теплового шока при тепловом стрессе или синтеза белков холодового шока при холодовом стрессе. При этом, если при стрессе в митохондриях сохраняется фосфорилирующая активность, то клетки растений остаются жизнеспособными, если же процесс фосфорилирования нарушен, то они погибают. В дальнейшем планируется выявить компоненты ЭТЦ митохондрий, ответственные за генерацию АФК при действии повышенных и пониженных температур на растения.

ACKNOWLEDGEMENT

Авторы благодарны за помощь в работе Т.Е. Путилиной. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 15-04-06533).