Теоретические и практические аспекты применения методов in vitro для интенсификации селекционного процесса у растений винограда (обзор)

С целью предотвращения заражения вирусами получены трансгенные растения с интегрированными генами белка вирусов растений винограда (11-13). Обычно вместе с генами, контролирующими хозяйственно ценные признаки, переносят и ге-32

ны устойчивости к антибиотикам канамицину или гигромицину в качестве селективных маркеров для отбора трансформированных генотипов винограда на клеточном уровне, вектором служит Ti-плазмида Agrobacterium tumefaciens или применяют «микробомбардирование» (4, 14).

С е л е к ц и я н а к л е т о ч н о м у р о в н е i n v i t r o . Клоновой селекции в полевых условиях можно противопоставить отбор устойчивых клеток в суспензионной культуре in vitro . Показано, что если проводить исследования в течение 1 года при объеме суспензионной культуры 3 л и использовании в качестве мутагенного фактора γ -облучения, то клеточная селекция по одному локусу гена будет приблизительно в 60 раз более эффективной, чем отбор среди 25 млрд растений в поле в течение 7 тыс. лет (15, 16).

На основе методов клеточной селекции получены растения-регенеранты сорта Шардоне (V. vinifera L.), обладающие повышенной хитиназной активностью, устойчивостью к E. ampelina (17). Разработаны методики селекции клеток винограда in vitro на устойчивость к пониженной температуре и щелочной реакции среды (высокая концентрация извести в почве) (18, 19).

Для эффективного практического применения методов генной инженерии и селекции на клеточном уровне необходимо разработать методы получения растений из устойчивых клеток суспензионных культур посредством соматического эмбриогенеза и способы диагностики селектируемых и других хозяйственно ценных признаков у растений-регенерантов in vitro .

Р е г е н е р а ц и я р а с т е н и й в и н о г р а д а и з к л е т о к с у с п е н з и о н н о й к у л ь т у р ы. Для образования проэмбриогенного каллуса винограда применяли твердую среду Nitsch-Nitsch (NN) с добавлением регуляторов роста — 2,4-дихлорфе-ноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и 6-бензиладенина (6-БА) (20). Затем каллус субкультивировали в жидкой среде и индуцировали образование из проэмбриогенных клеток суспензионной культуры соматических эмбриоидов (2123).

Для оценки зависимости соматического эмбриогенеза от сортовых особенностей мы исследовали 28 генотипов винограда различных эколого-географических групп (24) . В качестве исходных эксплантов использовали черешки листьев, взятые у растений, выросших in vitro . Для развития проэмбриогенной каллусной ткани среда NN была более эффективной по сравнению со средой Мурасиге-Скуга (МС) (25). В зависимости от генотипа для развития проэмбриогенной каллусной ткани требовались различные соотношения 2,4-Д и 6-БА в твердой среде NN (24). Ранее было показано, что 6-БА стимулирует развитие эмбриоидов из проэмбриогенных клеток как в жидкой, так и на твердой среде (23, 26, 27). Для развития глобулярных эмбриоидов проэмбриогенный каллус субкультивировали в жидкой среде NN с добавлением 0,5 мг/л 6-БА. При этом в 10 мл среды развивалось несколько тысяч глобулярных эмбриоидов размером 0,05-0,2 мм. Нам удалось индуцировать развитие глобулярных эмбриоидов у девяти генотипов винограда: Кобер 5ББ, 101-14, Зигфридребе, Бианка, Подарок Магарача, Первенец Магарача, Интервитис Магарача, Цитронный Магарача и Магарач 100-74-1-5 (24). У сортов Интервитис Магарача и Подарок Магарача в дальнейшем в этой же среде развивались и сердцевидные эмбриоиды; для массового образования последних у сорта Бианка требовалась еще одна инокуляция суспензии глобулярных эмбриоидов в такую же жидкую среду.

В дальнейшей работе суспензию глобулярных и сердцевидных эмбриоидов сортов Бианка, Интервитис Магарача и Подарок Магарача инокулировали в жидкую среду НТЕ, в состав которой входили следующие ингредиенты: NH4NO3, KNO3, MgSO4⋅7H2O, КН2РО4, СаСl2, мезоинозит, пиридоксин, тиамин, никотиновая кислота — соответственно 308, 922, 597, 82, 331, 20, 5, 5, 0,5 мг/л, 10 г/л сахарозы, а также Fe-хелат и микроэлементы МС с дополнительным добавлением 0,1 мг/л β-индолилуксусной кислоты (ИУК) (28). После 20 сут культивирования образовывались торпедовидные эмбриоиды длиной 2-3 мм, для увеличения количества которых иногда требовалась повторная инокуляция суспензии глобулярных, сердцевидных и торпедовидных эмбриоидов в такую же жидкую среду (24). ИУК стимулирует образование торпедовидных эмбриоидов винограда в жидкой и на твердой среде (23, 29).

Из соматических эмбриоидов винограда удалось получить побеги на средах, содержащих цитокинины — 2-изопентениладенин или 6-БА (22-24, 26-28, 30). По данным наших исследований, из 48 % торпедовидных эмбриоидов сорта Подарок Магарача образовывались побеги после 50 сут культивирования на твердой модифицированной среде МС (МlМС), содержащей мезоинозит, пиридоксин, тиамин, никотиновую и парааминобензойную кислоты, 6-БА (соответственно 100, 5, 5, 0,5, 5, 0,5 мг/л), сахарозу и агар-агар (соответственно 30 и 7 г/л), а также минеральные элементы МС. На этой среде хорошо развивались побеги из торпедовидных эмбриоидов сорта Интервитис Магарача, но очень плохо из таковых сорта Бианка (24). Стимулирование развития проростков с гипокотилями и семядолями зеленой окраски в среде НТЕ посредством добавления 0,5 мг/л гибберелловой кислоты (ГА 3 ) привело к тому, что после пересадки этих проростков на твердую среду М2МС (отличается от среды М1МС концентрациями тиамина и никотиновой кислоты — соответственно 0,5 и 5 мг/л) не только ускорялось развитие побегов, но и увеличивалась их доля у сортов Бианка, Интервитис Магарача и Подарок Магарача (83-88 %) (28).

По данным Krul с соавт., на среде, не содержащей гормонов, происходило размножение торпедовидных эмбриоидов. Для регенерации растений торпедовидные эмбриоиды размером 1-2 мм культивировали 7 сут на среде с 0,5 мг/л 6-БА, а затем, когда семядоли приобретали зеленую окраску, их переносили на безгормональную среду (31). Мы использовали жидкую среду, содержащую 0,5 мг/л 6-БА, для развития глобулярных и сердцевидных эмбриоидов, из которых после инокуляции в среду с 0,1 мг/л ИУК формировались торпедовидные эмбриоиды (23, 24). Эти эмбриоиды при культивировании в жидкой среде с 0,5 мг/л ГА 3 давали начало проросткам с гипокотилями и семядолями зеленой окраски, из которых при высадке на твердую среду с 0,5 мг/л 6-БА развивались побеги (23, 24, 28). Далее мы разрезали побеги на одноглазковые черенки с листом, которые высаживали на среду для получения растений. При необходимости растения размножали in vitro или пересаживали для адаптации к условиям in vivo по методикам Зленко с соавт. (32, 33).

Предлагаемую нами методику регенерации растений винограда посредством соматического эмбриогенеза в жидкой среде из клеток суспензионных культур можно применять для получения новых генотипов за счет сомаклональной изменчивости, генных и геномных мутаций под воздействием мутагенов (селекция на клеточном уровне), а также для регенерации растений из трансгенных проэмбриогенных клеток со встроенными в них генами, детерминирующими хозяйственно ценные признаки.

Выращивание сеянцев винограда из труд-нопрораст а ю щ и х с е м я н и о т б о р у с т о й ч и в ы х г е н о т и п о в н а у р о в н е з а р о д ы ш е й. По-прежнему является актуальным создание бессемянных сортов винограда с применением культуры in ovule (34). Для выведения бессемянных, а также столовых сортов винограда с мелкими и мягкими семенами растения выращивают из семян с недоразвитым зародышем и/или эндоспермом. Предложенный нами ранее способ выращивания растений винограда из труднопрорастающих семян позволяет снизить затраты труда по сравнению с обычной методикой вычленения и культивирования изолированных зародышей, а также увеличить приживаемость последних (35). Способ заключается в следующем: семена разрезают поперек и части с зародышами высаживают на жидкую питательную среду in vitro. Если, например, при селекции на бессемянность образуются недоразвитые зародыши (глобулярные, сердцевидные или торпедовидные), то такие части семян с зародышами высаживают в жидкие среды с регуляторами роста, способствующими дальнейшему развитию. В случае высадки частей семян с зародышами на ранней стадии развития последовательно меняют жидкие среды, что способствует дальнейшему развитию зародышей, и только развившиеся проростки длиной около 1 см с семядолями зеленой окраски и гипокотилями по отдельности извлекают пинцетом и высаживают на твердую среду с агаром и добавлением 0,5 мг/л 6-БА для индукции развития побегов. Введение в пи- тательную среду селективных факторов по признаку, например, устойчивости к засолению почвы дает возможность увеличить число изучаемых сеянцев, так как на селекционные участки в поле, имеющие ограниченные площади, будут высаживаться сеянцы, уже отобранные на уровне культивируемых in vitro зиготических зародышей, проростков и растений (19).

Диагностика хозяйственно ценных призна-ков на уро в н е к л е т о к и т к а н е й (к а л л у с), а т а к - ж е у с е я н ц е в и р а с т е н и й - р е г е н е р а н т о в i n v i t r o . Hoos с соавт. использовали суспензионные культуры единичных клеток растений винограда с убитым мицелием Botrytis cinerea для диагностики устойчивости различных генотипов к грибам этого вида и оценки защитной реакции клеток (пероксидазная активность, синтез виниферина и резверат-рола) (36). Диагностику устойчивости к токсинам Botrytis cinerea также можно проводить на уровне растений, культивируемых in vitro (37).

В каллусных тканях устойчивых генотипов винограда к Plasmopara viticola содержится больше производных галлокатехина, чем в таковых неустойчивых генотипов ( r = 92,2 %). Производные галлокатехина индуцируют синтез флавоноидов и суберина в клеточных стенках и играют главную роль в устойчивости каллусов (38). Инокуляцию листьев растений in vitro спорангиями P. viticola можно использовать для определения устойчивости генотипов винограда к этому виду грибов (39).

Мякоть ягод винограда на стадии физиологической зрелости состоит из паренхиматических клеток с большими вакуолями, где накапливаются углеводы, антоцианы и ароматические вещества (40). В культуре ткани при определенном составе среды можно вызвать образование каллусной ткани паренхиматического типа (41). Антоцианопластов содержится больше в цитоплазме, чем в вакуолях клеток суспензионных культур винограда (42). Каллусы, образующиеся in vitro из эксплантов листьев и черешков сортов, формирующих ягоды с кожицей и соком белой окраски, имели белую окраску; окрашенную кожицу и не окрашенный сок — красную окраску (в условиях освещения); окрашенные кожицу и сок — красную окраску (как в темноте, так и на свету) (43). О синтезе красящих веществ в каллусной ткани лозы винограда сообщали Изворска с соавт. и Haydu (44, 45). Выявленная корреляционная зависимость между содержанием антоцианов (моногликозидов и дигликозида мальви-дина) в кожице ягод и каллусе, развившемся из эксплантов междоузлий, листьев и черешков различных сортов винограда, позволяет селекционеру проводить раннюю диагностику этих признаков (46).

Одним из направлений селекционной работы в плане повышения засухоустойчивости, адаптивного потенциала и продуктивности является создание сортов, характеризующихся интенсивным развитием корневой системы. Выявлены контрастные различия по способности образовывать корни из каллусной ткани, развившейся из эксплантов листьев и черешков на среде Шенка-Хильдебрандта (47) с добавлением 1 мг/л α -нафтил-уксусной кислоты (НУК) и 0,2 мг/л 6-БА, между сортами с сильной и слабой корневой системой. Разработан способ диагностики генетической специфичности интенсивности развития корневой системы у сеянцев и сортов винограда (48, 49). По способности различных генотипов винограда образовывать каллус-ную ткань и корни in vitro на среде с добавлением NaCl (3 г/л) или сахарозы (100 г/л) определяют генетически детерминированные признаки устойчивости к засолению почвы или повышенной способности поглощать воду из почвы при засухе (15, 16).

Дальнейшие исследования по разработке селективных систем отбора клеток с измененным генотипом, а также методов оценки хозяйственно ценных признаков на уровне суспензий клеток, каллусных тканей и растений, культивируемых in vitro, наряду с применением методов генной инженерии, позволят создать сорта винограда, устойчивые к биотическим и абиотическим факторам внешней среды, обладающие высоким качеством урожая.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    S p a r v o l i F., M a r t i n С., S c i e n z a A. e.a. Cloning and molecular analysis of structural genes involved in flavonoid and stilbene biosynthesis in grape, Vitis vinifera L. Plant Mol. Biol., 1994, 24: 743755.

• 2.    L u o S.L., H e P.C., Z h o u P. e.a. Identification of molecular genetic markers tightly linked to downy mildew resistant genes in grape. Acta Genetica Sinica, 2001, 28, 1: 76-82.

• 3.    D o n a l d T.M., P e l l e r o n e F., A d a m - B l o n d o n A.F. e.a. Identification of resistance gene analogs linked to a powdery mildew resistance locus in grapevine. Theor. and Appl. Genetics, 2002, 104, 4: 610-618.

• 4.    F r a n k s Т., H e D.G., T h o m a s M. Regeneration of transgenic Vitis vinifera L . Sultana plants: Genotypic and phenotypic analysis. Mol. Breed., 1998, 4, 4: 321-333.

• 5.    T o r r e g r o s a L., V e r r i e s C., T e s n i e r e C. Grapevine ( Vitis vinifera L.) promoter analysis by biolistic-mediated transient transformation of cell suspensions. Vitis, 2002, 41, 1: 27-32.

• 6.    K i k k e r t J.R., H e b e r t - S o u l e D., W a 11 a c e P.G. e.a. Transgenic plantlets of Chancellor grapevine ( Vitis sp.) from biolistic transformation of embryogenic cell suspensions Plant Cell Rep., 1996, 15: 311316.

• 7.    S t r i e m M.J., R e i s c h B.J., K i k k e r t J.R. Differences in GUS expression among grapevine transformants. Acta Hort., 2000, 526: 437-443.

• 8.    M o z s a r J., V i c z i a n O., S U l e S. Agrobacterium -mediaied genetic transformation of an interspecific grapevine. Vitis, 1998, 37: 127-130.

• 9.    H a r s t M., B o r n h o f f В.-A., Z y p r i a n E. e.a. Influence of culture technique and genotype on the efficiency of Agrobacterium- mediated transformation of somatic embryos (Vitis vinifera) and their conversion to transgenic plants. Vitis, 2000, 39: 99-102.

• 10.    Y a m a m o t o Т., I k e t a n i H., I e k i H. e.a. Transgenic grapevine plants expressing a rice chitinase with enhanced resistance to fungal pathogens. Plant Cell Rep., 2000, 19: 639-646.

• 11.  L e G a l l O., T o r r e g r o s a L., D a n g l o t Y. e.a. Agrobacterium -mediated genetic transformation of

• 12.  S p i e l m a n n A., K r a s t a n o v a S., D o u e t - O r h a n d V. e.a. Analysis of transgenic grapevine

• 13.    M a r t i n e l l i L., C a n d i o l i E., C o s t a D. e.a. Stable insertion and expression of the movement protein gene of Grapevine Virus A (GVA) in grape ( Vitis rupestris S.). Vitis, 2002, 41, 4: 189-193.

• 14.    T o r r e g r o s a L., L o p e z G., B o u q u e t A. Antibiotic sensitivity of grapevine: a comparison between the effect of hygromycin and kanamycin on shoot development of transgenic 110 Richter rootstock (Vitic Berlandieri x Vitis rupestris). South African J. for Enology and Viticulture (Stellenbosch), 2000, 21, 1: 32-39.

• 15.    Z l e n k o V.A., T r o c h i n e L.P . Selection clonale de la vigne. In: 74^е Assembl e e G e n e rale de 1'OIV (Paris). Viticulture, 1994, 1: 1-14.

• 16.    З л е н к о В.А., Т р о ш и н Л.П. Клоновая селекция винограда in vitro . Виноградарство и виноделие, 1995, 1: 12-19.

• 17.    J a y a s a n k a r S., L i Z., G r a y D.J. In vitro selection of Vitis vinifera Chardonnay with Elsinoe ampe-lina culture filtrate is accompanied by fungal resistance and anhanced secretion of chitinase. Planta, 2000, 211: 200-208.

• 18.    Z h a n g M., R a j a s h e k a r C.B. Selection of cold tolerant cells of grapes in suspension culture. Plant Sci. (Shannon), 1994, 97: 69-74.

• 19.    З л е н к о В.А., К о т и к о в И.В., Т р о ш и н Л.П. Размножение оздоровленного посадочного материала винограда в культуре in vitro. Садоводство и виноградарство, 2005, 2: 21-23.

• 20.  N i t s c h J.P., N i t s c h С. Haploid plants from pollen grains. Science, 1969, 163: 85-87.

• 21.  R a j a s e k a r a n K., M u l l i n s M.G. Embryos and plantlets from cultured anthers of hybrid grapevines.

• 22.    L e b r u n L., R a j a s e k a r a n K., M u l l i n s M.G. Selection in vitro for NaCl-tolerance in Vitis rupe-stris Scheele. Ann. Bot., 1985, 56: 733-739.

• 23.    З л е н к о В.А., Т р о ш и н Л.П., Л е в е н к о Б.А. Методические указания по регенерации растений винограда в жидкой среде in vitro . M., 1990.

• 24.    З л е н к о В.А., Т р о ш и н Л.П. Соматический эмбриогенез в суспензионной культуре винограда in vitro . Цит. и ген., 1993, 27, 3: 53-63.

• 25.    M u r a s h i g e Т., S k o o g F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plantarum, 1962, 15: 473-497.

• 26.    M u l l i n s M.G., S r i n i v a s a n С. Somatic embryos and plantlets from an ancient clone of the grapevine (c.v. Cabernet Sauvignon ) by apomixis in vitro . J. Exp. Bot., 1976, 27: 1022-1030.

• 27.    S a l u n k h e C.K., R a o P.S., M h a t r e M. Induction of somatic embryogenesis and plantlets in tendrils of Vitis vinifera L. Plant Cell Rep., 1997, 17: 65-67.

• 28.    Z l e n k o V.A., K o t i k o v I.V., T r o s h i n L.P. Efficient GA 3 — assisted plant regeneration from cell suspensions of three grape genotypes via somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 2002, 70, 3: 295-299.

• 29.    M a r t i n e l l i L., B r a g a g n a P., P o l e t t i V. e.a. Somatic embryogenesis from leaf and petiole-derived callus of Vitis rupestris. Plant Cell Rep., 1993, 12: 207-210.

• 30.    G r a y D., M o r t e n s e n J. Initiation and maintenance of long term somatic embryogenesis from anthers and ovaries of Vitis longii «Microsperma». Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1987, 9: 73-80.

• 31.  K r u l W.R., N a r r a g a n s e t t R.I. In vitro propagation of grape. Pat. USA, 1987, 4, 714, 679.

• 32.  Z l e n k o V.A., T r o s h i n L.P., K o t i k o v I.V. An optimized medium for clonal micropropagation of

  grapevine. Vitis, 1995, 34: 125-126.

• 33.    S l e n k o W.A., T r o s c h i n L.P., K o t i k o w I.V. Der Einfluss der N a hrmedienzusammensetzung bei der in vitro-Vermehrung verschiedener Rebgenotypen. Mitteilungen Klosterneuburg, 2001, 51, 1: 15-26.

• 34.    D i n g H a n f e n g, Q i G u i m e i. Ovule culture and plant formation of hybrid progeny of seedless grapes. J. of Agriculture in the Tropics and Subtropics, 2001, 102, 2: 147-152.

• 35.    З л е н к о В.А., К о т и к о в И.В., Т р о ш и н Л.П. и др. Способ выращивания растений из трудно-прорастающих семян. Пат. Украины ¹ 17919 с приоритетом от 11.01.1995 г. Опубл. 28.02.2000 г. Бюл. изобр. и откр. ¹ 1; пат. России ¹ 2113111 с приоритетом от 26.01.1995 г.. Опубл. 20.06.1998 г. Бюл. изобр. и откр. ¹ 17.

• 36.    H o o s G., B l a i c t h R. Metabolism of stilbene phytoalexins in grapevines: oxidation of resveratrol in single-cell cultures. Vitis, 1988, 27: 1-12.

• 37.    V a n n e l D., B a r b i e r M., B e s s i s R. Etude de la toxicit e du filtrat de culture de Botrytis cinerea sur des vitroplants de vignes: I. Effect du filtrat brut. Vitis, 1991, 30, 3. 167-175.

• 38.    D a i G.H., A n d a r y C., M o n d o l o t - C o s s o n L. e.a. Involvement of phenolic compounds in the resistance of grapevine callus to downy mildew, Plasmopara viticola. European J. of Plant Pathol., 1995, 101, 5: 541-547.

• 39.    D a i G.H., A n d a r y C., M o n d o l o t - C o s s o n L. e.a. Histochemical responses of leaves of in vitro plantlets of Vitis spp. to infection with Plasmopara viticola. Phytopathol., 1995, 85, 2: 149-154.

• 40.    С т о е в К.Д. Физиологические основы виноградарства. София, 1973, Т. 2.

• 41.  К а л и н и н Ф.Л., С а р н а ц к а я В.В., П о л и щ у к В.Е. Методы культуры тканей в физиологии

  и биохимии растений. Киев, 1980.

• 42.  C a l d e r 0 n A.A., P e d r e n o M.A., M u n o z R. e.a. Evidence for non-vacuolar localization of antho

  cyanoplasts, anthocyanin-containing vesicles, in suspension cultured grapevine cells. Phyton (Argentina), 1993, 54: 91-98.

• 43.    Г о л о д р и г а П.Я., З л е н к о В.А., К а л у ц к а я Т.А. и др. Способ диагностики окраски кожицы и цвета сока ягод винограда. А.с. СССР ¹ 948339, МКИ³ AOIG 7/00. ¹ 3232084/30-15. Заявлено 04.01.1981; опубл. 07.08.1982. Бюл. изобр. и откр. ¹ 29.

• 44.    И з в о р с к а Н., Л и л о в Д. Образоване на пигментирани калуси от изолирани меристемни тькани от лоза. Физиол. на растенята, 1980, 4: 44-51.

• 45.    H a y d u Z. Application of in vitro cultures in the research on grapevine genetics. In: 4-th International symposium on grape-vine breeding. Verone (Italie), 1985: 25.

• 46.    Г о л о д р и г а П.Я., К о с т и к М.А., З л е н к о В.А. Прогнозирование некоторых компонентов качества урожая сортов и сеянцев винограда по каллусной ткани. Физиол. и биохим. культ, раст., 1986, 18, 5: 510-515.

• 47.    S c h e n k R.U., H i l d e b r a n d t А.С. Medium and techniques for induction and growth of monocotyle-donous and dycotyledonous plant cell cultures. Can. J. Bot., 1972, 50: 199-204.

• 48.    Г о л о д р и г а П.Я., З л е н к о В.А., Н и л о в Н.Г. Способ диагностики генотипической специфичности интенсивности развития корневой системы винограда. А.с. СССР ¹ 1384285, МКИ³ А01Н 1/04. ¹ 3965088/30-15. Заявлено 16.10.1985; опубл. 30.03.1988. Бюл. изобр. и откр. ¹ 12.

• 49.    G l e b a U.U., P i v e g n e N.M., G e n e e v S.U. e.a. Emploi de la culture in vitro dans la selection de la vigne. In: 68 Assembl e e G e n e rate de 1'OIV (Paris). Viticulture, 1988, 1: 1-21.

grapevine somatic embryos and regeneration of transgenic plants expressing the coat protein of grapevine chrome mosaic nepovirus (GCMV). Plant Sci., 1994, 102: 161-170.

(Vitis rupestris) and Nicotiana benthamiana plants expressing an Arabis mosaic virus coat protein gene.

Plant Sci. (Limerick), 2000, 156, 2: 235-244.

J. Exp. Bot., 1979, 30: 399-407.

Институт винограда и вина «Магарач»