Тепловизионная регистрация дефекаций и уринаций при оценке психоэмоционального состояния экспериментальных биообъектов в открытых аренах поведенческих тестов

¹ Введение. В поведенческих тестах оценки психо-эмоционального состояния подопытных биообъектов при проведении экспериментальных исследований и доклинических испытаний на безопасность и эффективность разнообразных, в том числе, экстремальных воздействий разной природы, одними из основных регистрируемых показателей, характеризующих, в частности, эмоциональную составляющую поведения, являются число болюсов и актов дефекации, пятен уринаций за период тестирования [1–4]. Увеличение количества вегетативных выделений в виде фекалий и мочи в комплексе с определенными значениями показателей двигательной активности свидетельствуют о состоянии повышенной эмоциональности у биообъектов.

При выполнении видеоанализа движений на основе безмаркерного компьютерного видеотрекинга на тепловизионных видеоизображениях с отчетливым выделением границ биообъектов при тестировании в установках «Открытое поле», «Приподнятый крестообразный лабиринт», «Радиальный восьмирукавный лабиринт» и «Т-образный лабиринт» было установлено, что инфракрасная камера также позволяет наблюдать и регистрировать в динамике исследования болюсы дефекаций и пятна уринаций, которые практически не различимы при использовании видеокамер, работающих в видимой области

спектра, особенно на темном фоне пола больших по размерам арен.

Цель: разработка способа выявления болюсов дефекаций и пятен уринаций при исследовании поведения экспериментальных биообъектов в открытых аренах этологических тестов с помощью тепловизионной регистрации.

Материал и методы. Для выявления и определения количественных показателей дефекаций и уринаций биообъектов использовали компактную тепловизионную камеру FLIR SC 660 (FLIR Systems) с широкоугольным объективом, устанавливаемую на операторском кране сверху открытых арен установок «Открытое поле», «Приподнятый крестообразный лабиринт», «Радиальный восьмирукавный лабиринт» и «Т-образный лабиринт» производства ООО «НПК Открытая наука» (Россия). Видеозапись осуществляли на сменные магнитные накопители тепловизора или передавали видеопоток на компьютер через устройства видеозахвата или по интерфейсу IEEE 1394.

В качестве объекта исследований использовали белых беспородных крыс-самцов весом 180–220 г, полученных из питомников филиалов «Столбовая» и «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Животные в виварии получали стандартный пищевой рацион (за исключением периодов пищевой депривации при исследовании оперантного поведения) и имели свободный доступ к воде.

Болюсы дефекаций и пятна уринаций подсчитывали в динамике индивидуального тестирования крыс при визуальном просмотре на экране записан- ных видеофайлов, а также в режимах on- и off-line с помощью нажатия заранее запрограммированных клавиш при использовании программного обеспечения безмаркерного видеотрекинга движений биообъектов типа Any-maze (Stoelting Co., США).

Результаты. При проведении экспериментальных исследований поведения лабораторных крыс с использованием батареи этологических тестов для оценки их психоэмоционального состояния при воздействиях различных факторов осуществляли регистрацию комплекса показателей, включая подсчет количества болюсов (или актов) дефекаций и пятен уринаций за период тестирования. В качестве методов этологических исследований использовали доступные для практического применения как в стационарных лабораторных условиях, так и в выездных экспериментальных медико-биологических исследованиях тесты «Открытое поле» и лабиринты разной конструкции: приподнятый крестообразный, Т-образный и радиальный восьмирукавный. Тестовые установки для изучения локомоторной активности биообъектов разборны, могут быть легко транспортированы и не содержат электронных и сложных механических компонентов.

Традиционно болюсы (или акты) дефекаций и пятна (следы) уринаций подсчитывают при визуальном осмотре тестовых арен, в основном после извлечения животного из установок. В данном случае их количество является интегральным показателем, не учитывающим изменения в динамике процессов дефекаций и уринаций. Непосредственное визуальное наблюдение за поведением, когда экспериментатор «нависает» над габаритной ареной с высокими стенками, двигается вокруг нее и тем самым взаимно находится в поле зрения биообъекта, может являться неконтролируемым отвлекающим фактором для животного. Необходимо также учитывать, что наиболее простой метод визуального наблюдения и «ручной» регистрации всего комплекса обширных этологических показателей требует от исследователя определенного навыка и быстроты реакции в случаях часто меняющихся, совпадающих по времени возникновения или чередующихся разнообразных паттернов поведения биообъектов.

Для исключения элементов субъективизма и соблюдения требований стандартизации, унификации и воспроизводимости получаемых результатов оценки двигательной активности биообъектов в настоящее время разработаны автоматические программно-аппаратные исследовательские средства и оборудование, использующие разного рода устройства замыкания электрических контактов, встроенные фото-, вибро- и тензодатчики, регистрирующие, например, пересечения инфракрасных лучей, локальные давления на пол камеры и др. В данных системах не предусмотрен учет болюсов дефекаций и уринаций. Перспективным направлением для изучения поведения является также использование методов видеотрекинга движений биообъектов. Наряду с этим, в видеопотоке и на видеозаписях, особенно при использовании тестовых арен с полом, окрашенным в темный цвет, болюсы дефекаций и пятна ури-наций не видны или практически не различимы.

Для объективизации, количественного анализа и документирования процессов вегетативных выделений в виде болюсов дефекаций и пятен уринаций в динамике тестирования поведения биообъектов в открытых аренах этологических тестов в качестве видеорегистрирующей аппаратуры, наряду с камерами, работающими в видимой области спектра, была использована тепловизионная камера. Последняя, помимо обеспечения для автоматического анализа изображений достаточного качества выделения границ тела тестируемого биообъекта от фона (пола арен), позволила визуализировать болюсы дефекаций и пятна уринаций, также отличающихся по температуре от ограждающих поверхностей (рис. 1).

Продукты вегетативных выделений в виде болюсов дефекаций и пятен уринаций сразу после попадания из организма животного в окружающею среду имеют температуру, схожую с внутренней температурой тела животного, и существенно отличаются от температурных показателей пола арен тестовых поведенческих установок, что позволяет выявлять и ре-

Рис. 1. Болюсы дефекаций и пятна уринаций на термоизображении при тестировании крысы в установке «Открытое поле». В левом нижнем углу аналогичный кадр видеозаписи в видимой области спектра гистрировать эти выделения с помощью тепловизионной камеры. При этом в видимой области спектра на значительных расстояниях от объектива камеры до пола арены, позволяющих поместить в кадре всю окрашенную в темный цвет (черный, темно-серый) тестовую установку, они практически не различимы. В первую очередь это относится к пятнам уринаций, являющихся прозрачной жидкостью.

Фекальные и мочевые выделения имеют разную консистенцию, структуру, форму и размеры. У интактных здоровых лабораторных крыс болюсы дефекаций чаще округлой (овальной) или слегка вытянутой формы и в основном располагаются по одному, реже — рядом, не перекрывая друг друга. Пятна уринаций имеют разный размер в зависимости от интенсивности мочевыделения и постепенно несколько растекаются на гладкой поверхности пола арены. Они могут менять размер при повторных попаданиях на них лап и хвоста животного и уменьшаются по мере высыхания (испарения жидкости).

Рис. 2. Болюс и пятна на термоизображении сразу после актов дефекации и уринации при тестировании крысы в установке «Открытое поле». В правом нижнем углу увеличенный в 4 раза фрагмент изображения

Рис. 3. Вид болюсов дефекаций и пятен уринаций на термоизображении при последующем тестировании крысы в установке «Открытое поле». В левом нижнем углу увеличенный в 4 раза фрагмент изображения

Скорость остывания болюсов дефекаций и пятен уринаций различается при одинаковых значениях температуры окружающей среды. Более плотные болюсы дефекаций большее время сохраняют температуру, близкую к температуре тела теплокровных животных, а следы уринации, как водная среда, быстро остывают и становятся холоднее ограждающих поверхностей тестовых установок. Изображения этих светящихся или более темных участков определенной формы на кадрах видеозаписей, полученных с помощью тепловизора, использованы для регистрации, подсчета и детального морфометрического анализа болюсов дефекаций и пятен уринаций, в том числе в динамике тестирования (рис. 2, 3). Одновременно возможно определение температурных показателей точечных участков и различных областей тела животного и регистрируемых выделений.

При исследовании поведения биообъектов морфометрический анализ размеров и пространственного расположения их вегетативных фекальных и мочевых выделений на кадрах видеофайлов (рис. 4) был проведен с помощью компьютерных программ анализа изображений типа ImageJ (National Institutes of Health). Определяли количество, линейные размеры (длина, ширина, диаметр, периметр, факторы формы — округлости, вытянутости и др.), площадные и координатные показатели болюсов дефекаций и пятен уринаций во всех или в заданных кадрах видеопоследовательности.

При проведении экспериментальных исследований психоэмоционального состояния биообъектов с помощью этологических тестов с тепловизионной регистрацией получаемые количественные данные используют для определения: разницы между показателями выборочных совокупностей подопытных и контрольных животных с помощью статистических критериев сравнения; зависимостей параметров воздействующих факторов и испытываемых средств на эмоциональность биообъектов; временных показа- телей возникновения, периодичности и частоты повторных актов дефекаций и уринаций с построением рядов динамики; корреляционных взаимосвязей с изменениями оцениваемых показателей спонтанной двигательной и других форм поведенческой активности экспериментальных животных; вероятностных характеристик (частоты встречаемости) возникновения у биообъектов подопытных и контрольных групп отклонений в эмоциональной сфере по градациям разной степени выраженности в зависимости от уровня дефекаций и уринаций; характеристик пространственного распределения болюсов дефекаций

Рис. 4. Изображения болюсов дефекаций и пятен уринаций в тесте «Открытое поле» для проведения морфометрического анализа. Желтым цветом обозначены болюсы дефекаций и тело крысы, зеленым — пятна уринаций и пятен уринаций в разных зонах тестовых арен в динамике исследования; степени влияния на эмоциональность биообъектов сезонных и суточных биоритмов, возрастных (весовых), половых и внутривидовых показателей и признаков, а также разных условий проведения этологических исследований в открытых аренах поведенческих тестов.

Получаемые результаты не зависят от цвета тестовых арен и окраски шерсти и кожи животных, а также условий освещенности области исследования. Тепловизионную регистрацию можно проводить при слабом или неравномерном освещении и в полной темноте. Данный подход также был использован для оценки эмоционального состояния биообъектов при тестировании оперантного поведения в открытых аренах разнообразных лабиринтов, в частности в радиальном восьмирукавном и Т-образном (рис. 5). Поскольку животных в этих тестах подвергают предварительной длительной пищевой депривации при свободном доступе к воде, большее значение в данном случае имеют показатели уринаций.

Видеокамеры с инфракрасной (ИК) подсветкой обеспечивают освещение ограниченного по площади участка тестовых установок, требуют дополнительного внешнего ИК-освещения или поднятия их на большую высоту, что не позволяет провести четкое определение и выделение на изображениях границ болюсов дефекаций и пятен уринаций в относительно больших аренах. Целесообразно также сопоставить результаты тепловизионной регистрации вегетативных выделений с аналогичными данными при использовании малодоступного в настоящее время дополнительного устройства нижней инфракрасной подсветки пола арен, которая позволяет выделять контуры биообъекта.

При отсутствии теплых и горячих предметов, внешних нагревателей и при достаточной активности животных какие-либо другие источники тепла в пределах тестовых арен отсутствуют. Целесообразно исключить локальные нагревы частей установок, обусловленные тепловым воздействием солнечных лучей, мощных устройств обогрева и отопления помещения. Необходимо также учитывать, что при длительной иммобильности животное собственным телом нагревает участки поверхности пола, на котором сидит. В этом случае очаги неоднородного свечения занимают относительно большую площадь, имеют

Рис. 5. Болюс дефекации и пятна уринаций на термоизображении при тестировании крысы в установке «Т-образный лабиринт»

менее четкие очертания и включают следы от соприкосновения с полом задних лап и основания хвоста.

Обсуждение. Результаты оценки работоспособности и психоэмоционального состояния биообъектов, как простейших биомоделей человека, имеют важное значение при экспериментальных исследованиях по определению безопасности и эффективности разнообразных, в основном малоизученных и экстремальных, факторов разной природы, а также разрабатываемых средств и способов защиты от них, медикаментозных средств профилактики и лечения на этапе доклинических испытаний [1, 3, 4]. Важно также учитывать, что отклонения в эмоциональном состоянии могут оказать существенное положительное или отрицательное влияние на эффективность деятельности и работоспособность индивида. В экспериментальных медико-биологических исследованиях при тестировании поведения биообъектов одними из основных признаков, характеризующих их эмоциональное состояние, являются количественные показатели дефекаций и уринаций. Болюсы дефекаций и пятна уринаций при этом подсчитывают при визуальном осмотре тестовых арен после окончания тестирования каждого животного.

В настоящее время тепловизоры широко применяют практически во всех отраслях науки и техники [5, 6]. В медицине успешно решают в первую очередь вопросы ранней диагностики ряда распространенных нозологий и оценки эффективности проведения лечебных мероприятий. Тепловизионное исследование является дистанционным, неинвазивным и безопасным. Существенное значение имеет использование современных тепловизоров для выявления лиц с повышенной температурой в местах скоплений людей, в основном в транспортных узлах. Использование тепловизора при исследованиях экспериментальных лабораторных крыс, несмотря на наличие у них шерстяного покрова, позволило четко определять их контуры [7, 8] практически в любых условиях содержания и тестирования, при этом проводят дистанционную термометрию разных участков тела животного [9], преимущественно в области глаз, внутренних поверхностей ушей и корня хвоста, где отсутствует волосяной покров.

Клинические анализы мочи и кала традиционно входят в перечень основных методов медицинской диагностики разнообразных патологических состояний и внутренних болезней [10]. При проведении экспериментальных исследований на биообъектах результаты количественной оценки частоты и степени выраженности конечных продуктов вегетативных выделительных функций в виде мочи и фекалий могут также иметь самостоятельное значение для диагностики соответствующих расстройств и патологических изменений мочевыделительной и пищеварительной систем.

Заключение. Использование при проведении экспериментальных исследований для оценки психоэмоционального состояния биообъектов тепловизионной камеры позволило выявлять и регистрировать в различных открытых аренах поведенческих тестов болюсы дефекаций и пятна уринаций в динамике наблюдения. Тепловизионная видеорегистрация позволяет также проводить детальный морфометрический анализ продуктов вегетативных мочевых и фекальных выделений биообъектов и определять показатели их пространственного распределения.