Терапия оригинальным антикон-вульсантом галодифом влияет на свойства бензодиазепиновых рецепторов тромбоцитов и уровни нейроактивных стероидных гормонов у больных алкоголизмом

ББК Р64-5.021-52

ТЕРАПИЯ ОРИГИНАЛЬНЫМ

АНТИКОНВУЛЬСАНТОМ ГАЛО-ДИФОМ ВЛИЯЕТ НА СВОЙСТВА БЕНЗОДИАЗЕПИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ТРОМБОЦИТОВ

И УРОВНИ НЕЙРОАКТИВНЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ У БОЛЬНЫХ АЛКОГОЛИЗМОМ

Шушпанова Т. В.*, Семке В. Я., Новожеева Т. П., Бохан Н. А.

ФГБУ «НИИ психического здоровья» СО РАМН 634014, Томск, ул. Алеутская, 4

Алкоголизм является одной из форм импульсивного поведения у больных, обусловленной общим дефицитом торможения. Более глубокое понимание механизмов регуляции процессов возбудимости мозга, определение мишеней действия алкоголя позволяет создать потенциально эффективную терапию, направленную на устранение последствий злоупотребления алкоголем и его отмены. Сравнительный анализ плотности бензодиазепиновых рецепторов (БДР) плазматических мембран тромбоцитов и уровней нейроактивных стероидных гормонов (НС) показал достоверное повышение плотности БДР, снижение прогестерона (ПГ) и тестостерона (ТС) в крови у больных алкоголизмом по сравнению с концентрацией ПГ и ТС у здоровых добровольцев; исследование уровня кортизола (КЗ) выявило значительное повышение концентрации данного стероида в сыворотке крови у больных алкоголизмом. Курсовое применение оригинального антиконвульсанта галодифа® (мета-хлор-бенгидрилмочевина) в течение 21 дня в суточной дозе 300 мг у больных в абстинентном и постабстинентном состоянии вызывало редукцию выраженности симптомов, характерных для синдрома отмены алкоголя. Терапия галодифом® приводила к нормализации баланса НС, модулирующих функцию ГАМКА/БДР, и к снижению плотности рецепторов до уровня контрольных значений, что является весьма перспективным в лечении алкогольной абстиненции и алкоголизма. Галодиф® снижал уровень КЗ на 138 % и повышал уровень ПГ на 160 % в сыворотке крови у больных алкоголизмом, приближая их к уровню гормонов у здоровых лиц. Изменение плотности БДР и уровней стероидных гормонов в крови больных алкоголизмом отражает нарушение регуляции стероидов (КЗ и ПГ) как одного из механизмов развития патологического влечения к алкоголю. Ключевые слова: оригинальный антиконвульсант галодиф, бензодиазепиновые рецепторы тромбоцитов, нейроактивные стероидные гормоны, больные алкоголизмом, терапия.

THERAPY WITH ORIGINAL ANTICONVULSANT GALODIF INFLUENCES ON PROPERTIES OF BENZODIAZEPINE RECEPTORS OF THROMBOCYTES AND LEVELS OF NEUROACTIVE STEROID HORMONES IN ALCOHOLIC PATIENTS. Shushpanova T. V., Semke V. Ya., Novozheeva T. P. «Mental Health Research Institute» SB RAMSci. 634014, Tomsk, Aleutskaya Street, 4. Alcoholism is one of forms of impulsive behavior in patients conditioned by common inhibitory deficit. Deeper understanding of mechanisms of regulation of processes of brain excitation, identification of targets for alcohol allows creation of potentially effective therapy directed at removal of consequences of alcohol abuse and withdrawal. Comparative analysis of density of benzodiazepine receptors (BDR) of plasmatic membranes of thrombocytes and levels of neuroactive steroid hormones (NS) has shown a reliable heightening of BDR density, decrease of progesterone (PG) and testosterone (TS) in blood of patients with alcoholism as compared with PG and TS concentration in healthy volunteers. Investigation of level of cortisol (CS) has revealed the considerable heightening of concentration of this steroid in serum of blood of alcoholic patients. Course application of original anticonvulsant Galodif ® (meta-chlor-benzhydrylurea) during 21 days at daily dose 300 mg in patients with withdrawal and post-withdrawal state has caused reduction of severity of symptoms, typical for alcohol withdrawal syndrome. Therapy with Galodif ® resulted in normalization of balance of NS, modulating function of GA-BA/BDR, and decrease of density of receptors up to level of control values that is very perspective in treatment of alcohol withdrawal and alcoholism. Galodif ® lowered level of CS by 138% and heightened level of PG by 160 % in serum of blood in alcoholic patients approximating them to level of hormones in healthy persons. Alteration of BDR density and levels of steroid hormones in blood of alcoholic patients reflects disturbance of steroid regulation (CS and PG) as one of mechanisms of development of craving for alcohol. Key words : original anticonvulsant Galodif, benzodiazepine receptors of thrombocytes, neuroactive steroid hormones, alcoholic patients, therapy.

Механизм формирования алкогольной зависимости и возникновения синдрома отмены алкоголя еще недостаточно изучен и понятен, несмотря на большое количество данных экспериментальных и клинических исследований. Алкоголизм является одной из форм импульсивного поведения у больных, обусловленной общим дефицитом торможения в поведении, или результатом нарушений, предвосхищающих негативные последствия алкоголизма. Нарушение процессов возбуждения и торможения в мозге может с высокой степенью риска являться основой развития алкоголизма. Возникновение рецидива у больных алкоголизмом часто связано с развитием тревоги при синдроме отмены хронического употребления этанола. Некоторые клинические симптомы, характерные для синдрома отмены алкоголя, являются общими среди пациентов с лекарственной зависимостью [23], вызванной злоупотреблением различных препаратов, в том числе бензодиазепинов. Более глубокое понимание механизмов регуляции процессов возбудимости мозга, вовлечённых в формирование алкогольной мотивации и зависимости, определение мишеней действия алкоголя даёт возможность разработать новые фармакотерапевтические подходы к лечению алкогольной зависимости, создать новые фармакологические препараты, действующие на эти мишени, потенциально эффективную терапию, направленную на устранение последствий злоупотребления алкоголем и его отмены [5, 7].

Исследования, проведённые на различных экспериментальных моделях животных, показали, что воздействие алкоголя приводит к снижению чувствительности к алкоголю и другим бензодиазепиновым агонистам [14, 15, 16, 22, 24]. Злоупотребление алкоголем вызывает развитие толерантности и зависимости, посредством взаимодействия этанола с ГАМКА/бензодиазе-пиновым рецепторным комплексом (ГАМКА/БДР) в различных структурах головного мозга [17]. ГАМКА/БДР – пентамерный макромолекулярный мембранный комплекс, имеющий места специфического связывания для многих лигандов, в том числе для у-аминомасляной кислоты (ГАМК), барбитуратов, бензодиазепинов, алкоголя, нейростероидов [13, 25]. Предполагают, что умеренные дозы этанола действуют, непосредственно связываясь с белками, которые формируют ГАМКА/БДР, связанные с CL–ионным каналом, функция которого аллостери-чески модулируется в разных областях мозга, участвующих в развитии эффектов этанола. Антагонисты ГАМКА-рецепторов способны препятствовать развитию эффектов этанола, ингибируя его седативное, анксиолитическое действие, а также подкрепляющий эффект этанола [1, 2, 15, 16, 17, 18]. Изучение генетических факторов, влияющих на предрасположенность к алкогольной аддикции и развитие алкогольной зависимости у человека в разных популяциях, подтверждает роль гена, кодирующего а2-субъединицу ГАМКА/БДР, в чувствительности к острому воздействию алкоголя и развитию алкогольной зависимости [18, 20]. Исследование ГАМКА/БДР в мозге у больных алкоголизмом в состоянии абстиненции с использованием позитронной и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии, основанной на поглощении радиоактивных лигандов [11C] флю-мазенила и [123I] иомазенила, показало снижение способности связывания рецепторов во фронтальной коре у этих пациентов [12, 14, 22], что может приводить к снижению ГАМКергиче-ской функции в мозге, нарушению процессов торможения в ЦНС и к развитию синдрома отмены алкоголя.

Одной из ведущих проблем в лечении алкоголизма является необходимость формирования новых подходов к профилактике и лечению этого заболевания, поиск эффективных фармакологических средств коррекции, действующих на молекулярные мишени влияния алкоголя в ЦНС, способных препятствовать развитию хронических эффектов алкогольной интоксикации и формированию зависимости [3, 25].

В связи с этим представляется актуальным изучение роли бензодиазепиновой рецепторной системы в развитии предпочтения к алкоголю и формировании алкоголизма, что может способствовать дальнейшему выяснению этиопа-тогенеза этого заболевания и поиску новых перспективных препаратов, необходимых для фармакотерапевтической коррекции.

Цель исследования – изучение влияния оригинального противосудорожного препарата га-лодиф® на свойства БДР плазматических мембран тромбоцитов и уровни нейроактивных стероидных гормонов у больных алкоголизмом. Галодиф® снижает алкогольную мотивацию у крыс с устойчивым предпочтением к этанолу в эксперименте и выраженность патологического влечения к этанолу у больных алкоголизмом за счёт редукции симптомов, возникающих при алкогольной абстиненции [4]. Нами исследовалась способность галодифа® оказывать модулирующее действие на БДР и нейроактивные стероидные гормоны у больных алкоголизмом, которые, в свою очередь, также проявляют свойства модуляторов ГАМКА/БД-рецепторов.

Материал и методы . В исследование вошло 36 пациентов – мужчин в возрасте от 23 до 52 лет, страдавших алкоголизмом II стадии (диагноз по МКБ-10: F10.302; F10.232), приходивших лечение в клинике ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН, и 20 добровольцев – мужчин, психически и соматически здоровых (контрольная группа). Все обследуемые - мужчины. Галодиф® назначали добровольцам в суточной дозе 300 мг (1 таблетка по 100 мг 3 раза в день) в течение 10 дней; больным алкоголизмом в суточной дозе 300 мг в течение 3 недель. Пациенты были информированы о проведении запланированных исследований и дали информированное согласие. Исследование одобрено этическим комитетом. Экспериментальная работа проводилась в лаборатории нейробиологии НИИПЗ СО РАМН (Томск) и лаборатории клинической биохимии Научного центра психического здоровья (НЦПЗ) РАМН (Москва).

Тромбоциты от пациентов и здоровых психически и соматически доноров были получены из венозной крови (30 мл) в каждом случае после перемешивания крови с 5 мл антикоагулянта – цитрата натрия (2,5 %), лимонной кислоты (1,37 %) и глюкозы (2 %) (рН=5,7). Плазма, обогащенная тромбоцитами (ПОТ), была получена низкоскоростным центрифугированием 200 g в течение 20 минут, при температуре 23ºС. Тромбоциты осаждали из ПОТ центрифугированием при 1500 g в течение 15 минут при 23ºС [4], отмывали трижды трис-НСL буфером (50 мМ, РН=7,4), замораживали и хранили при 70ºС до проведения радиоактивного связывания.

Свойства БДР периферического типа плазматических мембран тромбоцитов крови исследовали методом радиорецепторного анализа связывания селективного лиганда [3H]PK11195 (120 Ки/ммоль) с аликвотами мембранной суспензии, содержащей 50 мг белка при тмперату-ре 0°С в течение 90 минут. Концентрации лиганда составили 0,5–50 nM в отсутствии (общее связывание) и в присутствии (неспецифическое связывание) 1 мМ немеченного PK11195. Связанный лиганд во всех случаях отделяли фильтрацией через GF/B фильтры («Whatman», Англия). Радиоактивный анализ количества связанного лиганда проводили в сцинтилляционном р-счетчике ««Rack-beta» («LKB»). Константу диссоциации (Кд) и максимальное число мест специфического связывания (В макс ) определяли методом анализа кривых насыщения в координатах Скэтчарда. Неспецифическое связывание (менее 10 % общего связывания) было выявлено одинаковым в контрольных и опытных образцах. Скэтчард-блоты были линейны во всех анализируемых случаях, что подтверждает присутствие единственной популяции мест специфического связыания. Белок определяли по методу Лоури.

Для определения уровней стероидных гормонов прогестерона, кортизола и тестостерона были использованы соответствующие наборы гормонов для иммуноферментного анализа. В данной работе применялись наборы фирмы Био-Рад. Статистическая достоверность изменений изученных показателей осуществлялась посредством пакета программ «STATISTICA for Windows» v. 8.0.

Проведено изучение бензодиазепиновых рецепторов периферического типа (ПБР) циркулирующих тромбоцитов крови пациентов при алкоголизме и терапии препаратом галодиф. Исследованы свойства БДР тромбоцитов крови у больных алкоголизмом. Тромбоциты использовались нами в качестве экстрацеребральной модели для изучения свойств БДР у больных в состоянии алкогольной абстиненции и под влиянием терапии галодифом®. Исследования характеристик связывания [3H]PK11195 с ПБР тромбоцитов, полученных от больных алкоголизмом, выявили повышение плотности ПБР (В макс ) по отношению к контрольной группе (различия статистически значимы при р<0,05 (табл. 1). Значимых различий аффинности ПБР выявлено не было.

В результате проведённой терапии препаратом галодиф® выявленная плотность ПБР (В макс ) тромбоцитов у пациентов снижалась и приближалась к уровню показателя контрольной группы. В контрольной группе обследуемых добровольцев значимых различий плотности ПБР (В макс ) выявлено не было (рис. 1).

Таблица 1

Плотность связывания [3H]PK11195 с плазматическими мембранами циркулирующих тромбоцитов, полученных от больных алкоголизмом и здоровых добровольцев

Группа	Связывание [3H]PK11195 В макс (фмоль/мг белка)
	До терапии галодифом®	После терапии галодифом®
Добровольцы	±242 (n=19)	2920±156 (n=12)
Пациенты	4733*±379 (n=36)	3650*±259 (n=31)

Примечание. * – Уровень значимых различий p<0,005.

Mean±1,96*SE группа: добровольцы              группа: больные лечение

Рис. 1. Статистический анализ плотности связывания [3Н]PK11195 с мембранами циркулирующих тромбоцитов крови пациентов при алкоголизме и терапии препаратом галодиф®

Полученные нами ранее данные свидетельствуют о влиянии алкоголя на свойства БДР «центрального» и «периферического» типов головного мозга (исследования аутопсийного материала), что согласуется с изменениями свойств ПБР тромбоцитов больных алкоголизмом [9, 10]. Причём это влияние носит однонаправленный характер, отражающий адаптивные изменения БДР. Полученные результаты подтверждают специфичную роль БДР в обеспечении фармакологии ГАМКА/БД-рецепторного комплекса, его функции и, соответственно, в проявлении поведенческих эффектов, в том числе поведения, связанного с алкогольной мотивацией. Уровень плотности ПБР – наиболее чувствительный индекс повреждения нервной ткани, в особенности глиальных клеток. Пролиферация глии, сопровождающая нейрональные дегенеративные процессы, может быть связана с повышением плотности ПБР. Нами установлено, что галодиф® оказывает влияние на плотность ПБР тромбоцитов крови больных алкоголизмом, используемых в качестве экст-рацеребральной модели, снижая уровень ПБР.

Изучение уровней стероидных гормонов в плазме крови у больных алкоголизмом при терапии препаратом галодиф®. Некоторые естественно встречающиеся прегнан-стероиды (прогестерон и его активный метаболит – алло- прегнанолон) способны специфически усиливать ГАМКА-рецепторную функцию прямым (негеномным) способом. В результате они оказывают анксиолитическое, анальгетическое, противосудорожное, седативное, гипнотическое, анестезирующое свойства [19, 21]. Данные стероиды действуют не только как отдаленные эндокринные мессенджеры, но также могут быть синтезированы в мозге, где они модифицируют нейрональную активность локально, модулируя ГАМКА-рецепторную функцию, и могут обеспечивать поведенческие эффекты препаратов, обладающих психотропной активностью [25, 27].

Нами было проведено исследование уровней «нейроактивных» стероидных гормонов: прогестерона, тестостерона, кортизола в плазме крови у пациентов-мужчин с диагнозом «алкоголизм» до лечения и на фоне терапии препаратом галодиф®, показавшим положительную динамику в снижении выраженности патологического влечения к этанолу. Результаты исследований отражены в таблице 2.

При проведении сравнительного анализа уровней стероидных гормонов у больных алкоголизмом и добровольцев из группы контроля было установлено, что содержание прогестерона (ПГ) в крови было достоверно ниже у пациентов по сравнению с концентрацией этого гормона в контрольной группе. Содержание тестостерона (ТС) было также достоверно снижено в опытной группе по сравнению с контролем. Хроническое злоупотребление алкоголем значительно снижало концентрацию ПГ и ТС в крови у обследованных пациентов. ПГ является предшественником в цепи биосинтеза прегнан – нейростероидов, включая ТС. Сниженный уровень ПГ ведёт к снижению его производных, включая ТС. Исследование уровней кортизола у обследуемых в этих группах выявило повышенный уровень кортизола у больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой добровольцев, что соответствует данным других исследователей.

Таблица 2

Уровни стероидных гормонов в плазме крови у больных алкоголизмом и здоровых добровольцев

Тип гормона	Больные алкоголизмом (до терапии галодифом ® )	Больные алкоголизмом (после терапии галодифом ® )	Контрольная группа (здоровые добровольцы)
Кортизол, нмоль/л	661,31 ± 108,27*	478,52 ± 97,13	491,59 ± 68,23
Прогестерон, нмоль/л	2,65±0,32*	4,28 ± 0,63	3,99±0,54
Тестостерон, нмоль/л	17, 45±1,48*	25,65 ± 1,19	26,16 ± 1,29
	N=36	N=33	N=20

Примечание. * – Уровень значимых различий р<0,005.

Выявленное нами снижение уровня ПГ в крови у больных алкоголизмом свидетельствует о снижении ПГ – основного предшественника нейростероидов в ткани головного мозга. Показано, что хроническое воздействие алкоголя вызывает снижение аффинности БДР «центрального» и «периферического» типов в различных областях головного мозга пациентов, подвергавшихся хроническому влиянию алкоголя (данные постмортального исследования аутопсийно-го материала мозга человека) и компенсаторно повышает плотность этих рецепторов в условиях снижения ГАМКергической функции [9]. У больных алкоголизмом мы выявили повышение плотности бензодиазепиновых рецепторов «периферического типа» (ПБР) тромбоцитов [10], что может отражать изменение ПБР в ЦНС. Поскольку ПБР являются ключевым звеном на этапе синтеза стероидов, компенсаторное их повышение может свидетельствовать об усилении стероидогенной функции ПБР в периферических тканях и ЦНС. Выявленное снижение уровня ПГ может свидетельствовать об усилении метаболизма ПГ и образовании основного его метаболита – аллопрегнанолона, обладающего анксиолитическим действием на экстрасинаптических ГАМКА/БДР [25, 27], что может являться также компенсаторным механизмом в условиях дефицита ГАМК-функции. Повышение метаболизма ПГ приводит к снижению его уровня, возникновению дефицита как самого ПГ, так и его метаболитов, что также может вносить дополнительный вклад в формирование тревожных, пароксизмальных и компульсивных расстройств, вести к повышению судорожной готовности, выраженной вегетативной симптоматики, связанной с дефицитарным состоянием ГАМКергической нейротрансмиссии.

Курсовое применение галодифа® (21 день в суточной дозе 300 мг) у больных алкоголизмом вызывало редукцию выраженности симптомов, характерных для синдрома отмены алкоголя, снижение уровня плотности ПБР тромбоцитов крови пациентов и приводило к повышению уровня ПГ в крови у них почти до уровня контрольных значений. Уровень ТС в крови у обследуемых пациентов возрастал на фоне приема галодифа® в указанной дозе и приближался к уровню значений в контроле (см. табл. 2). Уровень кортизола у больных алкоголизмом был достоверно повышен относительно лиц контрольной группы и существенно понижался после терапии галодифом® (см. табл. 2).

Таким образом, выявлено, что галодиф ® оказывает модулирующее действие на содержание уровней стероидных гормонов, снижая уровень кортизола и повышая содержание прогестерона и тестостерона в крови у пациентов, получавших терапию с применением препарата галодиф ® . Полученные данные позволяют предположить, что изменение уровней нейроактивных стероидов и их метаболизма может представлять перспективу для развития новых подходов в терапии алкоголизма.

Полученные результаты подтверждают, что    10.

БДР являются мишенью молекулярного действия алкоголя на ЦНС и могут быть вовлечены в один из основных механизмов формирования     11.

влечения к алкоголю и развития алкоголизма. Выявленные изменения БДР «периферического» типа тромбоцитов и уровней стероидных гормонов у больных алкоголизмом отражают нарушение регуляции функционирования бензодиазепиновой рецепторной системы и синтеза нейроактивных стероидов, как одного из основных механизмов развития алкогольной зависимости. Использование галодифа® в качестве лечебного средства, имеющего воздействие на модуляцию БДР, уровни нейроактивных стероидных гормонов, улучшающего нейромедиацию ГАМК и ингибиторную функцию в ЦНС, обеспечивает новые фармакотерапевтические подходы к лечению алкогольной зависимости, абстинентного синдрома и формированию ремиссий, оказывая эффективное воздействие на подавление алкогольной мотивации.