Тестирование праймеров, сконструированных для детекции генов а-субъединицы бифенил-2,3-диоксигеназы бактерий, выделенных из загрязненных почв

Исследование разнообразия функциональных генов, кодирующих ключевые ферменты деструкции устойчивых ксенобиотиков, позволяет оценить биодеградативный потенциал микробного сообщества. Бифенил 2,3-диоксигеназа (БДО) является первым ферментом «верхнего» пути деструкции бифенила/ПХБ у бактерий [Pieper, 2005]. Структура ее активного центра, сформированного аминокислотами α-субъединицы (BphA1), определяет спектр утилизируемых конгенеров ПХБ – высокотоксичных стойких соединений, обладающих мутагенным и канцерогенным эффектом [Ross, 2004]. Известные праймеры для скрининга генов bphA1 [Witzig et al., 2006; Iwai et al., 2010] позволяют ам-плифицировать участок гена, кодирующий активный центр фермента. На основе известных нуклеотидных последовательностей генов α-субъединиц

БДО бактерий рода Rhodococcus , нами были подобраны вырожденнные праймеры (несколько вариантов прямого, forvard(F) – праймера и один обратный reverse(R)-праймер) к консервативным участкам гена bphA1 , позволяющие амплифициро-вать его фрагмент, соответствующий кластеру Риске [Шумкова, Плотникова, 2012]. Каждый вариант прямого праймера можно использовать в паре с обратным, для амплификации части гена, соответствующей кластеру Риске (450–500 п.н.); или с обратным праймером, предложенным S. Iwai с соавторами [2010] – для амплификации более протяженного участка гена bphA1 (около 1000 п.н.), кодирующего кластер Риске и активный центр фермента.

Цель данной работы – экспериментальная проверка праймеров и выявление наиболее оптимальных из них для исследования разнообразия бакте-

риальных генов, кодирующих α-субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназы.

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы. В работе использованы бактерии, выделенные из почвы, загрязненной (галоген)ароматическими соединениями (территория ОАО «Галоген», г. Пермь): Rhodococcus sp. P1, P2m, P2kr, P2(51), P12, P13, P20, Rhodococcus sp. P23a, G12a [Шумкова и др., 2014], Rhodococcus ruber P25(=ИЭГМ896) [Плотникова и др., 2012], Rhodococcus sp. G10; из почвы, загрязненной ПХБ (г. Серпухов, Московская обл.) Pseudomonas sp. S210, S211, S212; Rhodococcus sp. B7b, B106a [Шумкова и др., 2014], B7a [Eгорова и др., 2010], KT112-7 [Егорова и др., 2013] (почва, ОАО «Уралкалий», г. Березники, Пермский край). Кроме того, в настоящей работе были использованы штаммы бактерий-деструкторов ароматических соединений (из рабочей коллекции лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН) Arthrobacter sp. P24a,

Rhodococcus sp. G13mor, G13krg (почва, ОАО «Галоген», г. Пермь), R. ruber S9a (г. Серпухов, Московская обл.) и B107a-f, KT112-7b (почва, ОАО «Уралкалий», г. Березники, Пермский край). Бактерии были выделены из образцов почв методом накопительного культивирования, как описано [Шумкова и др., 2014].

Выделение тотальной ДНК и амплификация bphA1 генов. Выделение тотальной ДНК бактерий-деструкторов проводили по общепринятому методу [Ausbel et al., 1995]. Амплификацию bphA1 генов , кодирующих α-субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Б/Т ДО) [Gibbson, Parales, 2000], осуществляли с использованием праймеров, представленных в табл. 1 при условиях реакции, предложных S. Iwai с соавторами [2010].

Продукты реакции разделяли методом электрофореза в агарозном геле (1%) при напряжении 10 V/см, окрашивали раствором бромистого этидия (5 мкг/мл) и фотографировали в УФ-свете с использованием системы гель-документирования Gel DocTM XR («Bio-Rad Laboratories», США).

Таблица 1

Праймеры, использованные в работе, для амплификации генов bphA1

Название праймера	Направление синтеза цепи ДНК	Нуклеотидная последовательность праймера	Ссылка
BphA1F409	Прямой	5'-TTCTTGGCTGYTKHTSGSNCA-3'	Шумкова, Плотникова, 2012
BphA1F450	Прямой	5'-CCGGCGACTTYATSACSAMSTACAT-3'	Шумкова, Плотникова, 2012
BphA1F462	Прямой	5'-TGACCACGTACATGGGBGARGA-3'	Шумкова, Плотникова, 2012
BPHD-f3	Прямой	5'-AACTGGAARTTYGCIGCVGA-3'	Iwai et al., 2010
BphA1R900	Обратный	5'-TCSGCDGCRAWYTTCCAGTT-3'	Шумкова, Плотникова, 2012
BPHD-r1	Обратный	5'-ACCCAGTTYTCICCRTCGTC-3'	Iwai et al., 2010

Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей. Определение нуклеотидных последовательностей проводили с применением набора реактивов Big Dye Terminator Ready Reaction Kit v 3.1 («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL («Applied Biosystems», США), в соответствии c рекомендациями производителя. Сравнение выявленных нуклеотидных последовательностей bphA1 генов с гомологичными последовательностями, депонированными в GenBank (http:/www. , проводили с помощью алгоритма BLAST .

Результаты и их обсуждение

Тестирование сконструированных праймеров для амплификации фрагмента гена bphA1, соответствующего кластеру Риске БДО. Для экспериментальной проверки сконструированных праймеров была проведена ПЦР на ДНК-матрице грамположительных и грамотрицательных бактерий-деструкторов бифенила. У ряда исследуемых бактерий (штаммы, близкие по гену 16S рРНК R. wratislaviensis, бактерии родов Arthrobacter, Pseudomonas) ранее с праймерами, предложенными R. Witzig с соавторами [2006], были обнаружены гены bphA1 (кодирующие большую субъединицу БДО), относящиеся по классификации D. Gibbson и R. Parales [2000] к подсемейству би-фенил-толуол диоксигеназ (Б/Т ДО). Однако у бактерий, близких R. erythropolis, амплификации не наблюдалось [Шумкова и др., 2014].

Комбинации тестируемых праймеров, сайты их отжига на нуклеотидной последовательности гена bphA1 и ожидаемый размер ПЦР-продукта представлены в табл. 2.

С прямыми праймерами BphA1F409, BphA1F450, BphA1F462 в комбинации с обратным праймером BphA1R900 [Шумкова, Плотникова, 2012], а также с праймерами BPHD-f3/BPHD-r1 [Iwai et al., 2010], была проведена ПЦР (табл. 3). Наиболее успешно прошла амплификация с праймерами BphA1F450/BphA1R900. При использовании олигонуклеотидов BphA1F406/BphA1R900 концентрация полученно- го ПЦР продукта была наименьшей. Амплификация с праймерами BphA1F462/BphA1R900 помимо ПЦР-продукта ожидаемой длины давала более ко- роткий неспецифический ПЦР-продукт. С BPHD-f3/BPHD-r1 положительный результат получен для всех исследуемых штаммов (табл. 3).

Таблица 2

Характеристика участков генов bphA1 , амплифицируемых с разными комбинациями праймеров

Параметр	Праймер	BphA1F409	BphA1F450	BphA1F462	BPHD-f3
Амплифицируемый участок	BphA1R900	179 – 690	220 – 690	232 – 690	-
гена	BPHD-r1	179 – 1194	220 – 1194	232 – 1194	670 – 1194
Размер амплифицированного	BphA1R900B	511	470	458	-
фрагмента*	PHD-r1	1115	974	962	524
Соответствие функциональ-	BphA1R900B	к.Р.**	к.Р.	к.Р.	-
ным участкам белка	PHD-r1	к.Р.+а.ц.	к.Р.+а.ц.	к.Р.+а.ц.	а.ц.

* Размер амплифицированного фрагмента c указанным в данной графе обратным праймером (BphA1R900 или BPHD-r1)

** к.Р – кластер Риске, а.ц. – активный центр

Таблица 3

Результат амплификации короткого фрагмента гена bphA1 , соответствующего кластеру Риске

Штамм	Праймеры
	BphA1R900
	BphA1F406	BphA1F450	BphA1F462
Rhodococcus sp. P13	+	+	+
Rhodococcus ruber P25	-	-	+
Rhodococcus sp. G10	+	+	+
Rhodococcus sp. KT112-7b	+	+	+
Rhodococcus sp. KT112-7	+	+	+

Тестирование сконструированных праймеров в комбинации с обратным праймером, предложенным S. Iwai для амплификации протяженного фрагмента гена bphA1 , соответствующего кластеру Риске и активному центру БДО. Прямые праймеры BphA1F409, BphA1F450, BphA1F462 в комбинации с обратным BPHD-r1 [Iwai et al., 2010] были протестированы на ДНК-матрице 7 штаммов ( R. wratislaviensis KT112-7, Rhodococcus sp. KT112-7b, P13, G10, P23a, Rhodococcus ruber P25, Pseudomonas sp. S211). Наиболее успешно прошла амплификация с олигонуклеотидами BphA1F450/BPHD-r1: ПЦР-продукт ожидаемой длины (около 1000 п.н.) был получен для 4 штаммов: R. wratislaviensis KT112-7, Rhodococcus sp. P13 и G10, Pseudomonas sp. S211 (табл. 4). При использовании праймеров BphA1F462/BPHD-r1 ПЦР положительный результат получен для 2 из 7 штаммов: Rhodococcus sp. P23a и Pseudomonas sp. S211. С праймерами BphA1F409/BPHD-r1 амплификации не было ни в одном случае. Вероятно, это связано с большой степенью вырожденности праймера BphA1F409 [Шумкова, Плотникова, 2012].

Дальнейший анализ проводили с парами праймеров BphA1F450/BPHD-r1, BphA1F462/BPHD-r1 на ДНК-матрице 24 штаммов-деструкторов бифенила ( Rhodococcus sp. P1, P2m, P2kr, P2(51), P12, P13, P20, P23a, G10, G12a, G13mor, G13krg, B7a, B7b, B106a, B106a-f, KT112-7b, R. wratislaviensis KT112-7, R. ruber P25 и S9a, Arthrobacter sp. P24a, Pseudomonas sp. S210, S211,

S212) (табл. 4). При использовании праймеров BphA1F450/BPHD-r1 амплификация прошла успешно с ДНК-матрицы 20 штаммов, а с праймерами BphA1F462/BPHD-r1 ПЦР-продукт ожидаемой длины получен только для 13 штаммов (табл. 4). При этом с праймерами BphA1F462/BPHD-r1 прошла специфичная аплификация с ДНК-матрицы штаммов, близких по гену 16S рРНК R. erythropolis, R. ruber, Pseudomonas. Тогда как с праймерами BphA1F450/BPHD-r1 ампликоны ожидаемого размера (около 1000 п.н.) были получены с ДНК-матрицы штаммов, близких по гену 16S рРНК R. wratislaviensis.

Амплификации протяженного участка гена bphA1 R. ruber P25 (около 1000 п.н.) не было с парами праймеров: BphA1F450/BPHD-r1, BphA1F462/BPHD-r1. Однако удалось амплифици-ровать небольшие фрагменты, около 450–500 п.н., соответствующие кластеру Риске (с использованием олигонуклеотидов BphA1F462/BphA1R900) и активному центру фермента (BPHD-f3/BPHD-r1).

Таким образом, с праймерами BphA1F450/BPHD-r1 успешно амплифицировались bphA1 гены всех перечисленных групп бактерий (табл. 4), за исключением Arthrobacter , bphA1 , ген которого не удалось амплифицировать и с парой праймеров BphA1F462/BPHD-r1. Тогда как с олигонуклеотидами BphA1F462/BPHD-r1 удалось получить специфичный ПЦР-продукт с ДНК-матрицы псевдомонад, R. ruber S9a и бактерий, близких по гену 16S рРНК R. erythropolis (табл. 4).

Определение и анализ нуклеотидных последовательностей. Было проведено частичное секвенирование и последующий анализ полученного ПЦР-продукта для ряда штаммов. Амплифициро-ванные участки функциональных генов штаммов Rhodococcus sp. P1, P13 были сходны с генами α-субъединиц подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Б/Т ДО) известных бактерий-деструкторов ароматических соединений, представителей рода Rhodococcus. Фрагмент гена, амплифицированного на ДНК-матрице деструкторов бифенила Pseudomonas sp. S211, имел 100%-ное сходство с bphA1 геном известных грамотрицательных штаммов-деструкторов бифенила родов Achromobacter и Pseudomonas. Таким образом, нами амплифици-рованы более протяженные участки (около 1000 п.н.) тех же генов, короткие фрагменты которых были получены ранее [Шумкова и др., 2014] с помощью праймеров, предложенных R. Witzig [Witzig et al., 2006].

Таблица 4

Результат амплификации фрагментов гена bphA1 , включающего кластер Риске и активный центр фермента, и короткого фрагмента, соответствующего активному центру

	Праймеры
Штамм	BPHD-r1
	BphA1F450 1 BphA1F462 1 BPHD-f3

Штаммы, близкие по гену 16S рРНК Rhodococcus wratislaviensis

Rhodococcus sp. P1	+	-	н.о.*
Rhodococcus sp. P12	+	-	н.о.
Rhodococcus sp. P13	+	-	+
Rhodococcus sp. P20	+	-	н.о.
Rhodococcus sp. G10	+	-	+
Rhodococcus sp. KT112-7b	-	-	+
R. wratislaviensis KT112-7	+	-	+
Rhodococcus sp. B7a	+	-	+

Штаммы, близкие по гену 16S рРНК Rhodococcus erythropolis

Rhodococcus sp. P2m	+	+	-
Rhodococcus sp. P2kr	+	+	+
Rhodococcus sp. P2(51)	+	+	н.о.
Rhodococcus sp. P23a	-	+	+
Rhodococcus sp. G12a	+	+	+
Rhodococcus sp. G13mor	+	-	-
Rhodococcus sp. G13krg	+	+	н.о.
Rhodococcus sp. B7b	+	+	+
Rhodococcus sp. B106a	+	+	-
Rhodococcus sp. B106a-f	+	+	+

Штаммы Rhodococcus ruber

R. ruber P25	-	-	+
R. ruber S9a	+	+	+
Arthrobacter sp.
Arthrobacter sp. P24a	-	-	н.о.
Штаммы Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp. S210	+	+	н.о.
Pseudomonas sp. S211	+	+	+
Pseudomonas sp. S212	+	+	н.о.

*н.о. – не определяли.

Для штаммов Rhodococcus sp. B106a и G12a уровень сходства амплифицированных участков ДНК с генами bphA1 бактерий Rhodococcus sp. HA99 (AB272986), R04 (DQ403247), R. erythropolis TA421 (AB272985), R. rhodochrous K37 (AB272984), существенно отличающихся от известных генов, кодирующих α-субъединицы подсемейства Б/Т ДО, составил 99.9 и 100%, соответственно. Таким образом, подобранные праймеры позволяют получить информацию о генах, кодирующих α-субъединицы БДО различных подсемейств, в отличие от использованных ранее праймеров [Witzig et al., 2006].

Заключение

При амплификации короткого фрагмента гена bphA1 (450–500 п.н.), соответствующего кластеру Риске БДО, ПЦР-продукт в достаточной концентрации без примеси неспецифического продукта реакции был получен с праймерами BphA1F450/BphA1R900.

Показано, что c праймерами BphA1F462/BPHD-r1 (ограничивающих более протяженный участок bphA1 , включая кластер Риске и активный центр) успешно идет амплификация bphA1 генов псевдомонад и генов , сходных с bphA1 генами бактерий

Rhodococcus sp. HA99 (AB272986) и R04 (DQ403247), существенно отличающихся от известных генов, кодирующих α-субъединицы подсемейства Б/Т ДО.

C праймерами BphA1F450/BPHD-r1 успешно амплифицируются все перечисленные группы генов, включая bphA1 гены подсемейства Б/Т ДО. Праймеры обладают более широкой специфичностью по отношению к генам bphA1 , кодирующим α-субъединицам разных подсемейств.

Таким образом, праймеры BphA1F450/BPHD-r1 оптимальны для скрининга широкого спектра bphA1 генов, кодирующих α-субъединицы различных подсемейств.

Работа выполнена при поддержке Президиума РАН (Программа «Молекулярная и клеточная биология», УрО РАН, номер ГР проекта 01201256872) и гранта РФФИ-Урал № 13-04-96049 р_урал_а (номер ГР 01201365699).