The impact of experimental hypoxia and subsequent normoxia on the content of some ions and markers of physiological stress-adaptation in gastropod species Lymnaea stagnalis

Экологические характеристики видов в значительной степени определяются физиологическими и биохимическими процессами, происходящими на уровне клеточного метаболизма (Grieshaber et al ., 1994). Одними из ключевых показателей, отражающих состояние организма и происходящие в нём процессы, являются механизмы ионной регуляции и физиологические показатели стресс-адаптации (Frederich et al. , 2000). Исследование данных механизмов стресс-ответа у видов, обитающих в мелких пресноводных водоемах, представляет особый интерес, поскольку такие экосистемы в наибольшей степени подвержены различным антропогенным нагрузкам. В частности, летнее повышение температуры водоема приводит к понижению содержания растворенного кислорода в воде вследствие его диффузии в атмосферу и расходованием на окисление присутствующих в воде органических и неорганических загрязнителей (Konstantinov, 1986).

Эврибионтный палеарктический вид пресноводных легочных моллюсков Lymnaea stagnalis ( Linnaeus, 1758) является широко распространенным модельным объектом для исследования влияния условий среды обитания на физиологические и биохимические показатели стресс-метаболизма (Wijsman et al ., 1998; Gnatishina et al ., 2011; Coutellec et al ., 2006). В теплый период года L. stagnalis дышит преимущественно атмосферным воздухом, который поступает в непарное легкое через крупное закрывающееся дыхательное отверстие

(пневмостом). По этой причине в природе он встречается преимущественно в прибрежных или мелководных участках (до 1,5 – 2 м) водоемов, где имеет возможность периодически подниматься к поверхности воды. Отсюда содержание растворенного кислорода в воде обычно не рассматривается в качестве лимитирующего фактора среды для L. stagnalis . Однако данный вид поглощает атмосферный кислород через легкое и растворенный в воде кислород, через кожные покровы примерно в одинаковых количествах. При этом кислород, поглощенный легким, поступает в гемолимфу, а проникший диффузно через кожу (обычно не глубже 1 мм) - в тканевую жидкость (Stadnichenko et al. , 1996). При необходимости, например, при резком повышении уровня воды в водоеме и в зимний период, когда водоем покрывается льдом, L. stagnalis полностью переходит на дыхание растворенным в воде кислородом, заполняя легкое водой и поэтому, может оказываться в условиях гипоксии. Для оценки адаптивного потенциала L. stagnalis в условиях резких колебаний содержания растворенного кислорода в воде природных водоемах нами проведена экспериментальная оценка влияния гипоксии на содержание дыхательного пигмента гемоцианина, лактата и некоторых ионов (Na⁺, K⁺, Ca²⁺, NH⁴⁺, Mg²⁺) в его мантийной жидкости.

MATERIALS AND METHODS

Сбор взрослых представителей гастропод для данного исследования проводили с водной растительности у поверхности озера, расположенного в черте г. Иркутска на о. Юность (географические координаты: 52.268001, 104.280998; 52.268086, 104.284055.). Оценку влияния гипоксии проводили посредством экспонирования моллюсков в условиях экспериментальной гипоксии при содержании кислорода в воде 3 мг/л в течение шести часов и последующей нормоксии при 8-9 мг/л в течение трех часов при температуре вылова. При проведении экспериментов была использована вода из водоема в местах отлова моллюсков. Эксперименты проведены в гипоксических склянках с притертой крышкой при температуре вылова организмов – 20-22°С. Условия гипоксии достигались путем отсасывания кислорода из воды с применением мембранного насоса.

Оценку содержания кислорода в воде проводили с помощью оксиметра Extech Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter 407510 (США).

В ходе исследования проведена оценка содержания дыхательного пигмента гемоцианина, общего белка, лактата и некоторых ионов (Na⁺, K⁺, Ca²⁺, NH⁴⁺, Mg²⁺) в мантийной жидкости палеарктического вида гастропод. Мантийную жидкость для исследования получали путем легкого укола ноги моллюска энтомологической булавкой (Stadnichenko et al. , 1999).

Оценку содержания гемоцианина проводили при длине волны 335 нм, предварительно разбавив пробы в 100 раз и осадив форменные элементы центрифугированием в течение 5’ при 16100 rpm, 5°С (Frederich et al., 2000). Содержание гемоцианина и лактата проводили с помощью спектрофотометра CaryVarian – 50 (США). Измерение концентрации лактата проведено по стандартным протоколам «Лактат-витал» (Витал диагностикс, СПб) при длине волны 505 нм (Axenov-Gribanov, 2013).

Оценку содержания ионов (Na+, K+, Ca2+, NH4+, Mg2+) проводили с применением метода безреагентной ионной хроматографии на приборе ICS – 2000 (Германия). Измерение концентрации ионов проведено по калибровочным графикам для каждого анализируемого иона.

Все эксперименты проведены в 7 биологических повторностях. Биохимический анализ каждой пробы был проведен в 3-х аналитических измерениях. Оценку достоверности проводили, используя двувыборочный u-критерий Манна-Уитни. Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 8.0. На диаграммах указаны доверительные интервалы. * -обозначены случаи достоверного отличия значений от контрольного при доверительной вероятности – 0,95.

RESULTS AND DISCUSSION

В условиях экспериментальной гипоксии происходит повышение содержания гемоцианина с 62,31±10,95 мг/мл до 113,15,95±21,84 мг/мл (рис. 1А), что свидетельствует об активации физиологических реакций стресс-адаптации и об интенсификации транспорта кислорода в стрессовых условиях (Morris et al., 1988: Lorenzon et al., 2008). При этом важно отметить, нормоксия в течении 3 часов после 6 часовой гипоксии не приводила к восстановлению уровня гемоцанина до контрольных значений.

Принимая во внимание, что в ходе работы не отмечали изменения содержания лактата в мантийной жидкости относительно контрольных величин – 0,115±0,02 мМоль/г (рис. 1Б), это указывает на то, что данный тип стрессового воздействия не приводит к увеличению доли анаэробных процессов в клетке (Grieshaber et al ., 1994; Ekkekakis et al ., 2004) и существенных перестроек в метаболизме гастропод, затрагивающих биохимические и молекулярные механизмы стресс-адаптации не происходит.

Материалы по оценке содержания ионов Na⁺, K⁺, Mg²⁺ , NH⁴⁺ и Ca²⁺ в мантийной жидкости контрольной выборки L. stagnalis представлены на рисунке 2. Содержание ионов составило: Na⁺ -146,29±26,55 мМоль/л; K⁺ - 4,49±0,33 мМоль/л; Mg²⁺ - 14,37±2,41 мМоль/л; NH⁴⁺ - 1,04±0,11 мМоль/л; Ca²⁺- 21,08±5,19 мМоль/л.

В ходе исследования показано, что концентрации ионов Na+, K+, Mg2+ и NH4+ оставались неизменными в течение всего эксперимента, в то время как концентрация ионов Ca2+ повысилась уже к 3 часам экспозиции в условиях гипоксии до 35,07±6,52 мМоль/г и сохранялась на повышенном уровне после 3х часовой нормоксии от суммарной 6 часовой гипоксии (рис. 3).

По-видимому, индуцированное гипоксией среды обитания повышение концентрации Ca2+ в мантийной жидкости связано с выходом ионов в межклеточную среду из-за недостатка энергии, снижения интенсивности активного транспорта ионов и вымывания Ca2+ из раковины. Ранее проведенными исследованиями Мартемьянова В.И. (2011) на примере D. polymorpha показано, что повышенная концентрация Ca2+ в гемолимфе пресноводных двустворчатых моллюсков является защитной реакцией в ответ на разные по качеству экстремальные воздействия (температура, токсиканты) (Martem'yanov, 2011), что обеспечивает поддержание pH гемолимфы.

Таким образом, кратковременная индуцированная гипоксия приводит к активации физиологических механизмов стресс-адаптации у эврибионтного вида большого прудовика и не приводит к активации биохимических и молекулярных механизмов стресс-защиты.

В экспериментальных условиях при принудительном кожном дыхании (через покровы тела и заполненное водой легкое) выживаемость большого прудовика при температуре, близкой к 20^оС, не превышает 44-50 ч (Stadnichenko et al., 1996), что указывает на ограниченность физиолого-биохимических механизмов адаптации большого прудовика к дефициту растворенного кислорода в воде. Поэтому в теплый период года атмосферное дыхание у данного вида является преобладающим. В зимний период, при температурах, близких к 0^оС, потребности в кислороде у большого прудовика, как пойкилотермного организма, резко снижаются, что позволяет ему существовать исключительно за счет растворенного в воде кислорода.

Рисунок 1. Изменение содержания гемоцианина (1-А) и лактата (1-Б), в мантийной жидкости L. stagnalis при экспозиции в условиях гипоксии и нормоксии.

Рисунок 2. Содержание катионов в мантийной жидкости L. stagnalis в контрольных условиях.

Рисунок 3. Изменение содержания катионов в мантийной жидкости L. stagnalis при экспозиции в условиях гипоксии и нормоксии

ACKNOWLEDGEMENT

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ № 14-04-00501_а (приобретение расходных материалов), 14-3450051 (стажировка А.С.Хомича), РНФ 14-14-00400 (приобретение расходных материалов), базовой (1354) и проектной (6.382.2014) частей государственного задания, программы стратегического развития ФГБОУ ВПО «ИГУ» (приобретение расходных материалов), гранта молодых ученых ФГБОУ ВПО «ИГУ» и совместной программы академических обменов DAAD -Минобрнауки РФ М. Ломоносов 2014-2015.