The influence of carbohydrate status and low temperature on the respiratory metabolism of mitochondria from etiolated leaves of winter wheat

Митохондрии играют центральную роль в выступают в качестве сигнальных органелл, углеродном и энергетическом метаболизме клеток, участвующих в регуляции экспрессии ядерных генов и обеспечении устойчивости растений к различным стрессорам биотической и абиотической природы (Jacoby et al., 2012; Cvetkovska and Vanlerberghe, 2013; Li et al., 2013; Vanlerberghe, 2013). В митохондриях осуществляются процессы клеточного дыхания, конечным этапом которого является высвобождение свободной энергии, которая может быть использована для синтеза АТФ (Jacoby et al., 2012; Vanlerberghe, 2013). Метаболизм дыхания зависит от действия различных факторов внешней среды, в том числе низкой температуры. Дыхание – температурно-зависимый процесс – изменение температуры приводит к быстрому изменению интенсивности дыхания (Armstrong et al., 2008). Интермедиаты дыхания находятся на стыке процессов синтеза и распада различных соединений и играют ключевую роль в жизнедеятельности растительного организма (Semikhatova, Chirkova, 2001). Основными субстратами дыхания являются сахара (Golovko, 1999). Углеводный статус влияет на скорость дыхания листьев и корней растений (Noguchi, 2005). В зеленых листьях пшеницы обнаружена прямая корреляция между содержанием сахаров и скоростью дыхания и вкладом в дыхание цианидрезистентного альтернативного пути (АП) при 22 °С (Azcon-Bieto et al., 1983). Наиболее сильное увеличение скорости дыхания наблюдается при инкубации срезов листьев с такими водорастворимыми углеводами, как сахароза, глюкоза и фруктоза (Azcon-Bieto et al., 1983). Выращивание зеленых растений озимой пшеницы на растворе сахарозы при температурах 22 и 2 °С приводило к активации АП в митохондриях, изолированных из листьев этих растений (Borovik et al., 2013; Borovik, 2014). Альтернативный путь дыхания связан с функционированием альтернативной оксидазы (АО), которая является одной из терминальных оксидаз в дыхательной цепи митохондрий растений. На альтернативный путь дыхания электроны поступают с убихинон/убихинолового пула, минуя протонтранслоцирующие комплексы III и IV дыхательной цепи (Finnegan et al., 2004). Известно, что АО принимает участие в термогенезе специализированных тканей некоторых ароидных и лотосовых (Grant et al., 2008; Wagner et al., 2008). Функционирование АО может предотвращать образование АФК дыхательной цепью митохондрий (Maxwell et al., 1999; Blokhina and Fagerstedt, 2010), а также вносит важный вклад в регуляцию энергетического метаболизма клетки (Vanlerberghe, 2013). Функционирование АО может быть сопряжено с активностью ротенон-нечувствительных «внешних» и «внутренних» НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ (Elhafez et al., 2006; Smith et al., 2011; Tan et al., 2012; Vanlerberghe, 2013), что приводит к возможности свободного от фосфорилирования окисления НАД∙Н и НАДФ∙Н (Finnegan et al., 2004; Smith et al., 2011; Vanlerberghe, 2013). Такой путь транспорта электронов, по-видимому, необходим для поддержания оптимальной работы ферментов гликолиза, пентозофосфатного пути и цикла Кребса. Вероятно, в условиях действия низких температур альтернативный путь дыхания через ротенон-нечувствительные           НАД(Ф)∙Н- дегидрогеназы и АО может поддерживать дыхательный метаболизм в клетках растений и повышать их устойчивость к низкой температуре. В гетеротрофных тканях митохондрии являются основным источником энергии и одним из основных источников образования АФК (Møller, 2001). На 3-х суточных этиолированных проростках озимой пшеницы нами было показано, что при действии низких закаливающих температур возрастает вклад в дыхание АО при окислении митохондриями экзогенного НАД∙Н, и при этом повышается морозоустойчивость проростков (Grabelnych et al., 2014). Сохраняется ли способность к активации АО при действии низких температур в листьях этиолированных растений на более поздних стадиях развития, когда содержание сахаров истощается, неизвестно. В литературе отсутствуют сведения о связи углеводного статуса растений с функционированием ротенон-нечувствительных НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ и АО в митохондриях при действии низкой температуры. В связи с этим целью работы явилось изучение влияния низкой температуры и различной обеспеченности сахарами на функционирование «внешних» и «внутренних»          ротенон-нечувствительных

НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ и АО в митохондриях из этиолированных листьев озимой пшеницы.

MATERIALS AND METHODS

В работе использовали этиолированные растения озимой пшеницы ( Triticum aestivum L.)

морозоустойчивого сорта Иркутская. Растения выращивали в камере MIR-154 (“Sanyo”, Япония) на ½ раствора Кнопа при температуре 22±1 °С. Контрольные растения использовали в возрасте 7.5 суток (К). Для обогащения сахарами растения выращивали на 12%-ом растворе сахарозы, концентрация которой является оптимальной для эффективного закаливания озимой пшеницы при низкой температуре (Tumanov, 1979). На закаливание и обработку сахарами растения помещали в возрасте 7 суток (До обр). Растения выращивали при 22 °С в течение 7 суток на 12%ом растворе сахарозы (К+Сах) или закаливали в темноте при 2 °С в течение 7 суток в отсутствие (Зак) или в присутствии 12%-ой сахарозы (Зак+Сах). Растения в возрасте 7.5 суток соответствовали по ростовым параметрам закаленным 14-ти суточным растениям. В качестве дополнительного контроля (для анализа скорости роста и содержания углеводов) использовали 14-ти суточные растения (К,14), соответствующие по физиологическому возрасту закаленным растениям и растениям, выращенным на растворе сахарозы. Ингибирование роста определяли с помощью замера длины побегов 7-ми суточных растений до закаливания и обработки сахарозой и через 7 суток после закаливания при 2 °С и/или выращивания на растворе сахарозы. Контролем служили 14-ти суточные этиолированные растения, выращенные при 22±1 °С на ½ растворе Кнопа. Для определения угнетения ростовых процессов определяли степень ингибирования роста побегов (I, %) по формуле: (∆Lk - ΔLt)/ ΔLk×100%, где ΔLk – средний прирост побегов, не подвергнутых обработке; ΔLt – средний прирост побегов, подвергнутых обработке (Ivanov, 1974).

Содержание водорастворимых углеводов в этиолированных листьях определяли с использованием 0.2% антрона в концентрированной H2SO4 (Dishe, 1967). Для анализа содержания водорастворимых углеводов использовали калибровочную кривую, построенную по сахарозе.

Митохондрии из этиолированных листьев выделяли с помощью дифференциального центрифугирования и очищали в градиенте перколла по ранее описанной методике (Borovik et al., 2013) с изменением рН среды гомогенизации с 8.0 до 7.5. Для определения интактности выделенных митохондрий определяли проницаемость наружной мембраны митохондрий для экзогенного цитохрома с (Shugaev et al., 2012) в отсутствие и в присутствии детергента 0.04% Тритона Х-100.

Окислительную активность выделенных митохондрий регистрировали полярографически с платиновым электродом закрытого типа (электрод Кларка) в ячейке объемом 1.4 мл на полярографе ОН-105 (“Radelkis”, Венгрия) и Oxytherm system (“Hansatech Inst.”, Англия) при температуре 26 °С. Среда инкубации содержала 18 мМ КН2РО4 (рН 7.4), 300 мМ сахарозу, 125 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА и 0.3% БСА. В качестве субстратов окисления использовали 10 мМ малат в присутствии 10 мМ глутамата, 8 мМ сукцинат в присутствии 5 мМ глутамата, 1 мМ НАД∙Н и 1 мМ НАДФ∙Н. Глутамат добавляли для устранения оксалоацетатного ингибирования. При окислении НАД∙Н и НАДФ∙Н из среды инкубации исключали ЭДТА и вносили 3 мкМ ротенон (ингибитор транспорта электронов через комплекс I дыхательной цепи) и 0.06 мМ Ca2+ (активатор ротенон-нечувствительных НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ). Конечная концентрация АДФ в ячейке была 100 мкМ. Способность АО к транспорту электронов оценивали как скорость поглощения кислорода в состоянии 3, резистентную к 1.2 мМ цианиду калия (KCN) и ингибируемую 3 мМ бензгидроксамовой кислотой (БГК). Транспорт электронов через цитохромоксидазу (ЦО) оценивали как скорость поглощения кислорода в состоянии 3, ингибируемую 1.2 мМ KCN.

Проводили не менее трех независимых экспериментов. Представлены средние арифметические значения и их стандартные отклонения.

RESULTS AND DISCUSSION

Ингибирование роста

Выращивание растений на 12%-ом растворе сахарозы при 22 °С приводило к ингибированию роста побегов на 20% (Рис. 1). Холодовое закаливание, как в присутствии, так и в отсутствие сахарозы, приводило почти к полному ингибированию роста растений (на 96.4 и 93.8%, соответственно). При этом закаленные растения по длине побегов соответствовали 7.5 суточным контрольным растениям (Рис. 1). Торможение ростовых процессов у растений в условиях низких температур определяет успешность формирования устойчивости к низким температурам (Tumanov,

Trunova, 1958). Однако ингибирование роста происходит не только в результате понижения температуры, но и за счет накопления в тканях сахаров (Tumanov, Trunova, 1958).

Содержание водорастворимых углеводов

Содержание водорастворимых углеводов в листьях этиолированных растений озимой пшеницы при выращивании при 22 °С снижалось с возрастом растений (Рис. 2). Если у 7-ми суточных растений содержание сахаров в листьях составило 6.2%, то у 14-ти суточных всего 2.1%. Этиолированные растения в контрольных условиях выращивания обладали высокой способностью поглощать сахара из среды выращивания. Об этом свидетельствует повышение содержания водорастворимых углеводов в листьях при выращивании растений на растворе сахарозы (с 6.2% до 18%). Закаливание растений также характеризовалось увеличением содержания сахаров в листьях (Рис. 2). Наибольшее содержание водорастворимых углеводов наблюдали при закаливании на растворе сахарозы (18.4%), хотя при закаливании в отсутствие сахарозы также происходило накопление водорастворимых углеводов (до 10.6%), что вероятно, было связано с поступлением сахаров в листья в результате гидролиза крахмала эндосперма зерновки. Ранее было показано, что при закаливании на растворах сахарозы, рафинозы и мальтозы происходит их поглощение из наружного раствора, они проникают в клетки, превращаются в другие формы сахаров, благодаря чему общий пул сахаров возрастает (Trunova, 1972). Повышение содержания водорастворимых углеводов при закаливании является необходимым условием для эффективного повышения морозоустойчивости растений (Trunova, 1972).

Окислительная активность митохондрий и функционирование альтернативной оксидазы и ротенон-нечувствительных НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ

Окислительную активность митохондрий и функционирование альтернативной оксидазы и ротенон-нечувствительных НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ изучали на очищенных в градиенте перколла митохондриях из этиолированных листьев озимой пшеницы. Выделенные митохондрии характеризовались высокой степенью интактности внешней митохондриальной мембраны (86-88%) и способностью окислять все используемые субстраты дыхания (малат, малат в присутствии ротенона, сукцинат, НАД∙Н и НАДФ∙Н) (Рис. 3). Наибольшая величина коэфициента дыхательного контроля по Чансу-Вильямсу (Chance and Williams, 1956) была характерна для митохондрий, изолированных из листьев контрольных растений, при окислении малата (1.90±0.04).

Как видно из Рис. 3, митохондрии из листьев контрольных растений с наибольшей скоростью окисляли малат и экзогенный НАД∙Н и с наименьшей – малат в присутствии ротенона. Способность митохондрий окислять малат в присутствии ингибитора комплекса I дыхательной цепи – ротенона, свидетельствует об активности ротенон-нечувствительных «внутренних»

НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ, а способность митохондрий окислять экзогенные НАД∙Н или НАДФ∙Н в присутствии ротенона и Ca2+ в отсутствие в среде инкубации хелатирующего агента – о функционировании «внешних» НАД∙Н- и НАДФ∙Н-дегидрогеназ (Møller, 2001). С использованием ингибиторов ЦО и АО – KCN и БГК, соответственно, показано, что в митохондриях из этиолированных листьев озимой пшеницы функционирует цианид-резистентное дыхание, которое ингибируется БГК – ингибитором АО. Как оказалось, наибольший вклад в дыхание АО вносит при окислении митохондриями малата и малата в присутствии ротенона (Рис. 3).

Выращивание растений на растворе сахарозы при 22 °С, а также закаливание при 2 °С в присутствии и в отсутствие сахарозы, влияло на дыхательную активность митохондрий и изменяло вклад АО и ЦО в дыхание (Рис. 3). Наиболее существенные изменения наблюдали при выращивании этиолированных растений на растворе сахарозы в контрольных условиях (22 °С). В этих условиях отмечено увеличение скоростей дыхания при окислении всех используемых субстратов и увеличение вклада в дыхание как ЦО, так и АО. Увеличение скорости дыхания при окислении малата (в 1.4 раза) происходило за счет увеличения (в равной степени) вклада в дыхание путей, связанных с функционированием ЦО и АО. При окислении малата в присутствии ротенона увеличение скорости дыхания (в 1.3 раза) происходило за счет вклада в дыхание ЦО. Увеличение скорости окисления сукцината (в 1.5 раза) было обусловлено увеличением вклада в дыхание АО (в 2.6 раза). При окислении НАД∙Н и НАДФ∙Н скорости дыхания митохондрий увеличивались в 1.7 и 1.9 раза, соответственно. Такое существенное увеличение скоростей окисления происходило за счет активации и ЦО и АО, однако в большей степени АО (если вклад в дыхание ЦО увеличивался в 1.3 и 1.7 раза, то вклад в дыхание АО – в 2.9 и 2.5 раза, при окислении НАД∙Н и НАДФ∙Н, соответственно). Как следует из полученных данных, функционирование «внутренних» НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ в митохондриях из листьев растений, выращенных в контрольных условиях на растворе сахарозы, было сопряжено с функционированием ЦО, а не АО. В то же время функционирование «внешних» ротенон-нечувствительных НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ в митохондриях в этих условиях в большей степени сопряжено с активностью АО. Можно сделать вывод, что активность АО и «внешних» НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ в контрольных условиях выращивания растений озимой пшеницы определяется углеводным статусом. Полученные данные согласуются с имеющимися в литературе данными о положительной корреляции углеводного статуса растений и скорости дыхания и вклада в дыхание АО (Azcon-Bieto et al., 1983; Noguchi, 2005). В дальнейшем необходимо было выяснить сохраняется ли такая тенденция при действии на растения низких температур.

Длительное действие на растения низкой положительной температуры (2 °С, 7 суток)

(холодовое закаливание) приводило к значительным изменениям в скорости дыхания изолированных из листьев этих растений митохондрий. Закаливание растений в отсутствие сахарозы в среде выращивания снижало скорости дыхания изолированных митохондрий при окислении малата и малата в присутствии ротенона (на 19 и 16%, соответственно) (Рис. 3). Функционирование «внутренних» НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ в этих условиях снижалось за счет снижения активности АО (на 52%). Скорость окисления митохондриями сукцината, НАД∙Н и НАДФ∙Н не изменялась, однако при окислении сукцината было отмечено некоторое снижение вклада в дыхание ЦО (на 22%).

При закаливании растений на растворе сахарозы дыхательная активность изолированных из листьев митохондрий не изменялась при окислении всех изученных субстратов дыхания, за исключением экзогенного НАДФ∙Н, по сравнению с митохондриями из листьев контрольных растений (Рис. 3). Однако если сравнивать скорости дыхания митохондрий из листьев закаленных на растворе сахарозы и контрольных растений, выращенных на растворе сахарозы, то закаливание существенно снижало скорости дыхания митохондрий (Рис. 3). В то же время закаливание растений на растворе сахарозы сопровождалось перераспределением потока электронов между ЦО и АО в сторону увеличения их транспорта через АО. Такую ситуацию можно наблюдать при окислении митохондриями малата, сукцината и НАД∙Н (Рис. 3). Так, при окислении малата наблюдали увеличение дыхания через АО в 1.2 раза. При окислении сукцината увеличение скорости дыхания через АО (в 2.1 раза) было связано со снижением скорости дыхания через ЦО (на 31%), а при окислении НАД∙Н вклад ЦО в дыхание снижался на 25.6%, а вклад АО возрастал в 1.7 раза. Усиление дыхания при окислении НАДФ∙Н было связано с увеличением вклада в дыхание АО (в 1.8 раза). Таким образом, в условиях низких температур при высоком содержании водорастворимых углеводов активность «внешних» НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ сопряжена с активностью АО.

Известно, что гликолиз, цикл Кребса и цитохромный путь транспорта электронов – основной путь дыхания в листьях растений (Semikhatova, Chirkova, 2001). Показано, что при понижении внешней температуры снижается скорость транспорта электронов через цитохромный путь дыхания и активируется их транспорт по альтернативному пути (Ribas-Carbo et al ., 2000; Armstrong et al , 2008; Mizuno et al ., 2008). Как следует из наших данных, обеспеченность клеток сахарами – основными субстратами дыхания – влияет на дыхание митохондрий и транспорт электронов через цитохромный и альтернативный пути при низкой температуре. С использованием этиолированных растений озимой пшеницы нами выявлена зависимость функционирования АО и ротенон-нечувствительных НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ в митохондриях листьев от содержания сахаров.

Рисунок 1. Влияние сахарозы и низкой температуры на рост этиолированных растений озимой пшеницы.

Обозначения: До обр – растения до закаливания и обработки сахарозой; К – контрольные растения, выращенные при 22 °С в течение 7.5 суток; К,14 – растения, выращенные при 22 °С в течение 14 суток; К+Сах –растения, выращенные при 22 °С на 12%-ом растворе сахарозы; Зак – растения, закаленные при 2 °С; Зак+Сах – растения, закаленные при 2 °С на 12%-ом растворе сахарозы. n=3-5. M±S.D.

Рисунок 2. Влияние сахарозы и низкой температуры на содержание водорастворимых углеводов в листьях. n=3-8. M±S.D.

DAO

D ЦО

Рисунок 3. Влияние сахарозы и низкой температуры на скорость поглощения кислорода митохондриями в состоянии 3 и функционирование альтернативной оксидазы и ротенон-нечувствительных НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ.

Обозначения: Малат – 10 мМ малат в присутствии 10 мМ глутамата; Малат+Ротенон – 10 мМ малат в присутствии 10 мМ глутамата и 3 мкМ ротенона; Сукцинат – 8 мМ сукцинат в присутствии 5 мМ глутамата и 3 мкМ ротенона, НАД∙Н – 1 мМ НАД∙Н в присутствии 3 мкМ ротенона и 0.06 мМ Ca2+; НАДФ∙Н – 1 мМ НАДФ∙Н в присутствии 3 мкМ ротенона и 0.06 мМ Ca2+. n=3-6. M±S.D.

Содержание водорастворимых углеводов влияло на функционирование в митохондриях «внешних» НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ как в контрольных условиях выращивания, так и при закаливании растений в условиях низкой положительной температуры. Установлено, что благодаря высокому содержанию сахаров, активность «внешних» НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ и АО поддерживается на высоком уровне. Можно предположить, что в условиях доступности субстратов дыхания при действии на растения низкой температуры функционирование в митохондриях «внешних» НАД(Ф)∙Н-дегидрогеназ и АО способствует поддержанию необходимого уровня НАД(Ф)+ в цитозоле, что позволяет нормально функционировать НАД(Ф)+-зависимым дыхательным ферментам и обеспечивать необходимый уровень устойчивости растений к низкой температуре.