Токсичность яда обыкновенной гадюки Vipera berus для озерных лягушек Pelophylax ridibundus

В настоящее время мы полагаем, что в Волжском бассейне обыкновенная гадюка представлена двумя подвидами – номинативным Vipera berus berus и лесостепным, или гадюкой Никольского V. b. nikolskii . По морфологическим данным, зона интерградации двух подвидов занимает значительную часть бассейна Волги: наиболее «чистые» популяции номинативного подвида известны для отдельных регионов Верхнего Поволжья, а в других поволжских популяциях обнаруживаются морфологические признаки обеих форм, при этом подвидовые признаки V. b. nikolskii наиболее выражены у водораздела с Донским бассейном. Районы Донского бассейна, прилегающие к Волжскому бассейну, населяют популяции с преобладанием признаков V. b. nikolskii [1, 2, 8, 10-12, 14, 15].

Одним из диагностических признаков гадюки Никольского является бесцветный яд, у номинативного подвида он желтого цвета [15]. По характерному пептидному составу яда к V. b. nikolskii относится часть гадюк из популяций у границы речных бассейнов Волги и Дона, остальные гадюки из Волжского бассейна имеют пептидный состав яда, характерный для V. b. berus [1, 2, 10]. Кроме различий в пептидном составе, у двух подвидов гадюк в ядовитом секрете были отмечены статистически значимые различия в активности ферментов – протеазы и оксидазы L-аминокислот [7].

В то же время, токсичность яда (среднесмертельная доза ЛД 50 ), ранее определенная нами на белых лабораторных мышах при подкожном введении, для данных подвидов гадюк не различается [9] – в яде гадюк номинативного подвида ЛД 50 составляет 3,0–4,7 мкг/г, а в яде гадюки Никольского – 2,9–4,1 мкг/г. В.Г. Старков и соавторы

• [16 ] также не обнаружили значительных различий в токсичности яда вышеуказанных подвидов для банановых сверчков Gryllus assimilis : среднесмертельная доза яда номинативного подвида равна 81,9 мкг/г, а яда гадюки Никольского – 84,8 мкг/г.

В данной работе на сеголетках озерной лягушки были определены значения среднесмертельной дозы ЛД 50 образцов яда обыкновенных гадюк разной подвидовой принадлежности и из различных популяций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальные животные . Все эксперименты по токсикометрии ядов обыкновенной гадюки были проведены на сеголетках озерной лягушки Pelophylax ridibundus . Сеголетков озерной лягушки отлавливали в пойме р. Ахтуба (Красноярский район Астраханской области, окрестности ст. Досанг) в конце августа – начале сентября 2013 г. В опытах использовали лягушат массой 2,0–3,5 г за исключением тех случаев, когда нужны были лягушки другой массы. После отлова лягушек выдерживали сутки при комнатной температуре (25–27°С) для опорожнения кишечника, взвешивали на электронных весах «Ohaus Scout Pro» и формировали разные весовые группы (2,1–2,5 г, 2,6–3,0 г и 3,1–3,5 г). Для определения ЛД 50 одного образца яда использовали лягушек одной весовой группы.

Образцы ядов гадюк. Образцы ядов обыкновенной гадюки представляли собой яд, полученный от нескольких гадюк (от 10 до 30 экз.) из одной популяции и отловленных в одно время. Образцы яда были получены от гадюк, отловленных в 2009–2013 гг. в бассейне Средней и Нижней Волги и прилегающих к нему районов Донского бассейна, и хранились в лаборатории в условиях, обеспечивающих сохранность их биологической активности в течение нескольких лет. Для удобства обозначения образцов яда использовали их географическую приуроченность к местам отлова гадюк. В экспериментах использовали водные растворы ядов в концентрации 5 мг/мл для номинативного подвида обыкновенной гадюки и 2 мг/мл для яда гадюки Никольского.

Токсикометрия . Определение среднесмертельной дозы ЛД 50 ядов гадюк проводили стандартным методом, принцип которого подробно описан в литературе [3, 4, 13]. Для определения значения среднесмертельной дозы проводили инъекции возрастающих доз водных растворов яда группам экспериментальных животных одинакового веса. В каждом эксперименте использовали 30 лягушек – 6 групп лягушек по 5 особей; животным в группах вводили по 5, 10, 15, 20, 25, 30 мкл раствора яда. Инъекции растворов ядов гадюк проводили внутрибрюшинно в правую нижнюю четверть брюшной поверхности лягушки с использованием микрошприца объемом 0–30 мкл («Chirana», Чехия). В качестве контроля использовали группу лягушек (5 шт.), которым вводили максимальный объем (30 мкл) дистиллированной воды. В наших экспериментальных условиях лягушки контрольных групп оставались живыми не только в течение времени наблюдения (24 часа), но и в течение последующих трех– четырех суток. Эксперименты по токсикометрии проводили при комнатной температуре (25–27°С), и наблюдение прекращали через 24 часа после введения яда, подсчитывая число погибших и выживших животных.

Пробит-анализ. Для каждого образца яда проводили как минимум два независимых определения ЛД50 в одинаковых условиях. Значение среднесмертельной дозы ЛД50 рассчитывали ме- тодом модифицированного пробит-анализа [4]. Среднее значение ЛД50 рассчитывали по результатам двух независимых острых опытов, объединяя в одну линейку все эффективные дозы. При этом количество экспериментальных групп лягушек увеличивалось в два раза (с шести до двенадцати), а количество животных в группе оставалось неизменным (5 особей). Значения среднесмертельной дозы ядовитого секрета выражали в мкг яда/г веса экспериментальных животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Отловленные для экспериментов озерные лягушки были представлены двумя фенетическими формами: «полосатая» – со светлой дорсомеди-альной полосой (морфа «striata») – и «бесполо-сая», причем соотношение двух форм варьировало в разных биотопах. Как известно из литературных источников [5, 6], эти две формы (у лягушек озерной и остромордой) отличаются уровнем и скоростью метаболизма, степенью накопления ряда элементов, интенсивностью легочного дыхания, продолжительностью жизни и устойчивостью к антропогенной трансформации среды. Такие физиологические различия двух морф не исключают возможности искажения результатов токсикометрических экспериментов. Поэтому первоначально мы определили значение среднесмертельной дозы ЛД 50 яда обыкновенной гадюки для лягушек разных морф, но одной весовой группы (табл. 1).

Таблица 1. ЛД 50 яда обыкновенной гадюки для разных морф озерной лягушки

Морфа	ЛД 50 , мкг/г M ± m		t ф	P
со светлой продольной полосой на спине	35,3±3,31	37,3±2,58	0,53	>0,05
	39,8±3,46
без светлой продольной полосы на спине	39,3±6,40	39,5±3,29
	39,8±3,46

Примечание: в эксперименте использовали яд гадюк номинативного подвида из Нижегородской области, концентрация яда 5 мг/мл; масса лягушек в группах 2,0-3,5 г.

Как видно из табл. 1, достоверных различий в значениях ЛД 50 не выявлено, что говорит об одинаковом результате воздействия ядовитого секрета на две разные морфы озерных лягушек с отмеченными выше особенностями метаболизма. Тем не менее, в дальнейших экспериментах мы все-таки старались использовать лягушек одной морфы – бесполосых, встречаемость которых в местах отлова была значительно выше.

Заметим, что для групп лягушек с большей средней массой абсолютное значение ЛД 50 оказалось ниже такового для лягушек в группах меньшей массы. Значения ЛД 50 яда гадюк из Новгородской области на лягушках разных весовых групп (1,6–2,0, 2,1–2,5 и 3,6–4,0 г) составили 52,3,

• 46, 3 и 33,4 мкг/г соответственно. Поэтому в дальнейших экспериментах мы старались проводить два определения ЛД 50 одного образца яда на лягушках сходных весовых групп.

Для выявления подвидовых различий в токсичности ядов гадюк мы проанализировали ЛД 50 образцов ядовитого секрета гадюк разной подвидовой принадлежности из разных популяций в Волжском и Донском речных бассейнах. Результаты этих экспериментов приведены в табл. 2, где данные ранжированы в порядке снижения значений ЛД 50 и, соответственно, возрастания токсичности образца яда.

Значения ЛД50 всех исследованных образцов ядов разбиваются на две большие группы, разли- чающиеся между собой. Это - группа высоких значений ЛД50, характерная для яда обыкновенных гадюк с преобладающими признаками номинативного подвида, и группа низких значений ЛД50, характерная для яда гадюк с преобладающими признаками лесостепного подвида. При сравнении значений ЛД50 ядов номинативного и лесостепного подвидов выявлено, что у первого подвида они многократно (в 3-6 раз) и статистически значимо выше. Это свидетельствует о том, что яд гадюки Никольского значительно более токсичен для озерных лягушек по сравнению с таковым у гадюк номинативного подвида. Полученные данные мы не можем объяснить пищевыми предпочтениями двух подвидов гадюк, поскольку они расходятся с нашими представлениями о незначительных различиях в трофиче ских преференциях. На наш взгляд, анализу соответствия токсичности ядов гадюк их пищевым предпочтениям необходимо уделить более пристальное внимание, включив в экспериментальное определение ЛД50 более широкий спектр пищевых объектов, отмеченных в литературе.

Значения ЛД₅₀ яда гадюк из разных популяций с преобладанием признаков V. b. berus различаются между собой: наименее токсичный яд имеют гадюки из Республики Татарстан (ЛД₅₀=51,9±4,43 мг/г), а наиболее токсичный яд получен от гадюк из Пермского края (ЛД₅₀=30,6±1,96 мг/г). Различия этих значений ЛД 50 статистически значимы ( t ф =4,40, Р <0,001). А значения ЛД₅₀ яда из разных популяций с преобладанием признаков V. b. nikolskii практически одинаковы и не имеют между собой статистически значимых различий.

Таблица 2. Географические различия ЛД₅₀ яда обыкновенной гадюки для озерной лягушки

Преобладают признаки подвида	Место отлова	Цвет яда	ЛД 50 , мкг/г, M±m
V. b. berus	Республика Татарстан, Лаишевский район	желтый	51,9±4,43
	Республика Мордовия, Ковылкинский район	желтый	50,8±4,89
	Самарская область, Ставропольский район	желтый	48,8±5,05
	Самарская обл., г. Самара	желтый	47,4±3,31
	Республика Чувашия, Алатырский район	желтый	42,3±4,50
	Новгородская область, Боровичский район	желтый	41,1±3,87
	Нижегородская область, Тоншаевский район	желтый	37,2±2,60
	Московская область, Раменский район	желтый	32,7±4,58
	Пермский край, Чердынский район	желтый	30,6±1,96
V. b. nikolskii	Липецкая область, Добровский район	бесцветный	10,9±1,13
	Пензенская область, Пензенский район	бесцветный	9,9±1,51
	Саратовская область, Хвалынский район	желтоватый	9,6±1,91
	Саратовская область, Аткарский район	бесцветный	9,2±1,68
	Пензенская область, Пензенский район	желтоватый	8,9±1,59

В табл. 2 отмечен также цвет ядовитого секрета гадюк из исследованных популяций. Напомним, что у гадюк номинативного подвида мы всегда отмечали яд ярко-желтого цвета, тогда как у гадюк Никольского встречается и бесцветный, и желтоватый яд (слабой желтой окраски) [2, 7]. Сравнение значений ЛД50 бесцветного и желтоватого яда у гадюк из Пензенского района Пензенской области не выявило статистически значимых различий. Ранее проведенный биохимический анализ яда гадюк Никольского из этих популяций показал, что данные образцы отличались активностью оксидазы L-аминокислот, которая и опре- деляет цвет ядовитого секрета. Получается, что, несмотря на значительные различия в активности оксидазы L-аминокислот у особей в популяциях, токсичность их яда для сеголеток лягушек одинакова.

Таким образом, анализ среднесмертельной дозы ЛД50 образцов ядовитого секрета обыкновенной гадюки выявил межподвидовые и внутрипо-двидовые различия в его токсичности для озерной лягушки, биологический смысл которых пока неясен. В частности, необъясненным остается тот факт, что для лягушек яд гадюки Никольского более токсичен, чем яд гадюк номинативного подвида.

Нам представляется перспективным сравнительный анализ ЛД 50 яда одного и того же образца яда гадюк на разных пищевых объектах. Это позволит построить сравнительный ряд токсичности ядовитого секрета для нескольких видов добычи и выявить возможную связь пищевых преференций гадюк с токсичностью их ядовитого секрета.