Токсичность новых фунгицидов для эукариотических микроорганизмов, изолированных из кишечника продовольственно значимого опылителя овощных культур Bombus terrestris L.

В настоящее время в мире наблюдается тенденция снижения численности опылителей [1–3]. Вымирание шмелей и пчел уже является вопросом продовольственной безопасности [4] поскольку опыление насекомыми является обязательным условием получения урожая энтомофильных культур потребляемых в пищу человеком. Одной из возможных причин этому является токсическое действие пестицидов [5–7].

This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License

В последнее время было предположено, что резкому снижению численности насекомых-опылителей способствует синергетическое действие пестицидов и болезней, которые поражают опылителей [13–15]. Пестициды снижают общий иммунитет насекомых, что приводит к их повышенной восприимчивости к патогенам. Среди патогенов важнейших опылителей выделяют эукариотические микроорганизмы (патогены грибковой природы). Актуальным в настоящее время является поиск фунгицидов, которые способны эффективно уничтожать различные грибковые патогены, но при этом не причинять вреда полезным насекомым, таким как пчелы и шмели. В данной работе нами было исследовано влияние новых биоразлагаемых фунгицидов на эукариотические микроорганизмы, изолированные из личинок шмелей Bombus terrestris L . Кроме того, было оценена токсичность данных соединений на шмелей.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования было выбрано 4 вновь синтезированных фунгицида, разработанных в НИИ Органической химии им. Зелинского (г. Москва, Россия):

• •    фунгицид 1-7-Hexyl-1,4-dimethyl-2,3,5,6-tetraoxabicyclo[2.2.1] heptanes;

• •    фунгицид 2-7-(1-Adamantyl)-1,4-dimethyl-2,3,5,6-tetraoxabicyclo[2.2.1] heptanes;

• •    фунгицид 3-7-Isopentyl-1,4-dimethyl-2,3,5,6-tetraoxabicyclo[2.2.1] heptanes;

• •    фунгицид 4-3-(4-Methoxyphenyl)-6,7 a-dime-thyltetrahydro-3Н,4Н-3,6-epoxy[1,2] dioxolo[3,4-b] pyran.

Самцы и личинки шмелей B. terrestris L. были использованы для исследования влияния фунгицидов.

Посев содержимого кишечника личинок шмелей осуществляли на среду Сабуро: панкреатический гидролизат рыбной муки – 10 г/л; панкреатический гидролизат казеина – 10 г/л; дрожжевой экстракт – 2 г/л; NаН 2 РО 4 – 2 г/л; Д-глюкоза – 40 г/л; агар микробиологический – 10 г/л; рН 6,0. Для подавления роста посторонней микрофлоры в среду перед посевом вносили 0,1% раствора хлорамфеникола.

Для испытания на фунгицидную активность наводили растворы веществ в ДМСО. Полученные растворы добавили в разогретую до 50 ºС среду Сабуро. Приготовленные таким образом среды разлили по 15 мл в чашки Петри с внутренним диаметром 9 см.

Поверхность среды инокулировали кусочками мицелия трехдневной культуры грибов либо 100 мкл культуры дрожжей. Чашки Петри помещали в термостат при 25 ºС и держали в течение 72 часов. Затем измеряли диаметр колоний мицелиального микроорганизма либо осуществляли подсчет выросших колоний дрожжевого микроорганизма.

ДНК выделяли из выросших на среде Сабуро колоний с использованием набора Проба-ГС (ДНК-технология, Россия). ДНК выделяли в соответствии с протоколом, приложенным к набору.

Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием Taq-полимеразы на приборе Mastercycler personal (Eppendorf, Германия). Смешивали в пробирке 0,25 мл следующие компоненты: 5Х реакционная смесь (Евроген, Россия) – 5 мкл; 5 мкМ прямой праймер – 1 мкл; 5 мкМ обратный праймер – 1 мкл; ДНК – 2 мкл; деионизованная вода – до 25 мкл. Использовали следующий температурный цикл: 94 °С 4 мин, 35 циклов: 94 °С 30 сек 54 °С 30 сек, 72 °С 45 сек, конечная элонгация 72 °С 10 мин. В качестве праймеров использовали следующие: прямой IТS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG, обратный IТS4TCCTCCGCTTATTGATATGC [16]. Визуализацию продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.

Извлечение из агарозного геля и очистку ампликона проводили с помощью коммерчески доступного набора Cleanup Standard (Евроген, Россия). Секвенирование очищенных продуктов ПЦР проводилось на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3730 с использованием BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. В качестве праймеров для секвенирования использовались те же, что и для амплификации целевого фрагмента (IТS1 и IТS4).

Для исследования токсичности новых фунгицидов для насекомых исследуемые вещества добавляли в 500 мкл ДМСО, после чего полученный раствор разбавляли в 10 мл дистилированной воды. В качестве контрольного раствора использовали раствор дистиллированной воды (10 мл) в который предварительно добавляли 500 мкл ДМСО. Шмелей аккуратно с помощью пинцета в течение 1 сек помещали в пробирку с раствором. После чего их держали в течение 2 часов в специализированном садке с фильтровальной бумагой на дне садка для того чтобы они обсохли. Далее шмелей помещали в цилиндрические садки (диаметр – 14 см, высота – 7 см) с сетчатым дном и крышкой, по 10 шмелей в каждом садке. Инвертированный сахарный сироп (60%) использовали в качестве корма. Шмели содержались при температуре 27–28,5 °С и при влажности воздуха 55–68%.

Для измерения полетной активности шмели (3 шт.) помещались в прозрачную камеру: длина 25 см, ширина 15 см, высота 20 см. Для освещения использовали лампу дневного света. Далее каждые 5 сек регистрировали количество шмелей, находящихся в состоянии полёта. Измерение проводили в течение 20 мин. После чего высчитывали среднее количество шмелей, которые находились в состоянии полета в течение этого времени.

Результаты и обсуждение

Первоначально содержимое кишечника личинок шмеля высевали на универсальную питательную среду для грибов. По истечении 3–5 суток отбирали отдельные колонии, выделяли из них ДНК и осуществляли амплификацию маркерного для грибов региона (IТS1 и IТS2), после чего амплифицированные области секвенировали. Полученные нуклеотидные последовательности сопоставляли с международной системой GenBank. В результате были идентифицированы следующие эукариотические микроорганизмы: Lachancea thermotolerans, Naganishia adeliensis, Penicillium commune, Rhodotorula mucilaginosa. При этом при анализе 10 образцов личинок шмелей изолированных из различных колоний, было выявлено, что наиболее часто встречаемые в кишечнике личинок шмелей эукариотические микроорганизмы были P. commune (80% образцов) и R. mucilaginosa (70% образцов). Поскольку эти эукариотические микроорганизмы наиболее часто встречались в кишечнике личинок шмелей и в норме в кишечнике личинок не должно содержаться каких-либо эукариотических микроорганизмов (как мицелиальных грибов, так и дрожжей), дальнейшие исследования новых фунгицидов проводились с данными микроорганизмами.

Исследуемые новые фунгициды добавляли в питательную среду в концентрациях 0,005; 0,02; 0,05 и 0,1 г/л и затем вносили на чашки Петри. На рисунке 1 изображено влияние различных концентраций фунгицида 1 на диаметр мицелиального гриба P. commune

При внесении фунгицида № 1 в концентрации 0,005 г./л игибирующего действия на рост мицелиального микроорганизма не было (по отношению к контрольному образцу, в котором препарат отсутствует). При увеличении концентрации фунгицида, наблюдалось слабое ингибирование роста гриба. Максимальное ингибирование роста гриба (на 25%) наблюдалось в концентрации фунгицида в питательной среде 0,1 г/л.

На рисунке 2 изображено влияние различных концентраций фунгицида 2 на диаметр мицелиального гриба. В концентрации 0,1 г/л данный фунгицид ингибировал рост P. commune на 48%.

На рисунке 3 изображено влияние различных концентраций фунгицида 3 на диаметр мицелиального гриба. Небольшое ингибирование роста мицелиального гриба (на 18%) наблюдалось уже при концентрации фунгицида 0,005 г./л. Однако затем, с повышением концентрации фунгицида, дальнейшего подавления роста гриба не наблюдалось.

При исследовании влияния фунгицида 4 на рост гриба P. commune было выявлен, что данный фунгицид достоверно снижает скорость роста гриба на 19% только в концентрации 0,05 и 0,1 г/л (рисунок 4).

Далее нами оценивалось ингибирующее действие новых фунгицидов на количество выросших колоний дрожжевого микроорганизма R. mucilaginosa . Так, фунгицид 1 в концентрации 0,1 г/л сокращал количество выросших колоний на 17% (рисунок 5).

Фунгицид 2 показал высокую активность против дрожжей R. mucilaginosa . Уже при концентрации фунгицида 0,005 г./л количество колоний дрожжей сократилось в два раза, а при концентрации 0,05% фунгицид полностью подавил рост колоний дрожжей (рисунок 6).

Слабый ингибирующий эффект на рост дрожжей R. mucilaginosa оказал фунгицид 3. В максимальной концентрации фунгицида количество колоний дрожжей уменьшилось только на 24% (рисунок 7).

Фунгицид 4 показал высокую активность против дрожжей R. mucilaginosa в максимальной концентрации. В концентрации фунгицида 0,1 г/л количество колоний дрожжей сократилось в 16,4 раза (рисунок 8).

Рисунок 1. Влияние фунгицида 1 на рост гриба P. commune

Figure 1. Effect of fungicide 1 on the growth of the fungus P. commune

Рисунок 2. Влияние фунгицида 2 на рост гриба P. commune

Figure 2. Effect of fungicide 2 on the growth of the fungus P. commune

Рисунок 3. Влияние фунгицида 3 на рост гриба P. commune

Figure 3. Effect of fungicide 3 on the growth of the fungus P. commune

Рисунок 6. Влияние фунгицида 2 на количество колоний дрожжей R. mucilaginosa

Figure 6. Effect of fungicide 2 on the number of colonies of yeast R. mucilaginosa

Рисунок 4. Влияние фунгицида 4 на рост гриба P. commune

Рисунок 7. Влияние фунгицида 3 на количество колоний дрожжей R. mucilaginosa

Figure 7. Effect of fungicide 3 on the number of colonies of yeast R. mucilaginosa

Figure 4. Effect of fungicide 4 on the growth of the fungus P. commune

Копиейграция фунгицида, г/л Fungicide concentration, g/L

Рисунок 5. Влияние фунгицида 1 на количество колоний дрожжей R. mucilaginosa

Рисунок 8. Влияние фунгицида 4 на количество колоний дрожжей R. mucilaginosa

Figure 8. Effect of fungicide 4 on the number of colonies of yeast R. mucilaginosa

Figure 5. Effect of fungicide 1 on the number of colonies of yeast R. mucilaginosa

На следующем этапе оценивалось влияние новых фунгицидов на полётную активность самцов шмелей. В ходе эксперимента было выявлено, что новые фунгициды даже в максимально возможной концентрации (0,1 г/л) не снижали полётную активность насекомых. В то время как классический фунгицид дифеноконазол снизил полётную активность B. terrestris L. в 1,43 раза. Гибель шмелей не вызвал ни один фунгицид.

Таким образом, нами было показано, что исследованные вещества (см. материалы и методы) имеют фунгицидную активность как по отношению к мицелиальным эукариотическим микроорганизмам, так и по отношении дрожжевым эукариотическим микроорганизмам. По отношению к дрожжевым микроорганизмам исследованные вещества оказывали более выраженную фунгицидную активность. Среди исследованных веществ наиболее эффективным оказался фунгицид 2 (7-(1-Adamantyl)-1,4-dimethyl-2,3,5,6-tetraoxabicyclo[2.2.1]heptanes). Это вещество наиболее сильно подавляло рост P. commune (на 48%) и полностью подавляло рост дрожжевого микроорганизма (R. mucilaginosa).

Примечательно, что исследованные новые фунгициды не снижали полетную активность B. terrestris . Это говорит о том, что данные вещества избирательно токсичны только для грибов и не оказывают выраженного токсического эффекта на животных, в частности насекомых. Таким образом, они могут быть потенциальными эффективными препаратами для лечения инфекций насекомых-опылителей, вызванных грибковыми микроорганизмами.

Заключение

В ходе проведенных исследований было показано, что исследованные новые фунгициды способны ингибировать рост как мицелиальных эукариотических микроорганизмов, так и дрожжевых эукариотических микроорганизмов.

Среди исследованных веществ наиболее эффективным оказался фунгицид 2 (7-(1-Adamantyl)-1,4-dimethyl-2,3,5,6-tetraoxabicyclo[2.2.1] heptanes). При этом исследованные вещества избирательно токсичны только для грибов и не оказывают выраженного токсического эффекта на животных, в частности насекомых и могут быть использованы для лечения инфекций насекомых-опылителей, вызванных грибковыми микроорганизмами. Таким образом, применение новых биоразлагаемых фунгицидов для лечения болезней шмелей, вызванных эукариотическими микроорганизмами, позволит получить экологически чистую овощную продукцию и, в целом, повысит продовольственную безопасность населения.

Работа выполнена в рамках нацпроекта «Наука» (проект FZGW-2020-0001, уникальный номер реестра государственных заданий 075001X39782002) и при поддержке гранта Президента РФ для молодых кандидатов наук (проект MK-3173.2019.11)