Транскрипционная активность CSPG4/ NG2 как прогностический маркер послеоперационного течения глиобластом

Глиобластома – злокачественная опухоль головного мозга, характеризующаяся выраженным инвазивным ростом и неблагоприятным прогнозом. В опухолях происходит изменение экспрессии многих генов, в частности гена CSPG4/NG2 , играющего значительную роль в пролиферации опухолевых клеток глиобластомы и неоваскуляризации опухоли. До сих пор остается неясной возможность его использования как маркера прогноза лечения новообразования.

Материал и методы

Проведено клиническое и молекулярно-биологическое исследование 8 пациентов с диагнозом «Глиобластома». Образцы опухолей фиксировали в растворе RNA-later (LifeTechnologies, США). Экспрессии CSPG4/ NG2 и CD44 оценивали с помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени; в качестве контрольного гена использовали GAPDH . Пациентов разделили на две группы по показателю постоперационной выживаемости: группа 1 – выживаемость менее 1 года, группа 2 – выживаемость более 1 года после удаления опухоли.

Результаты

Молекулярно-биологические исследования показали значительное увеличение уровня экспрессии CSPG4/ NG2 в опухолях пациентов 1-й группы (в среднем в 4 раза) по сравнению с уровнем экспрессии в опухолях 2-й группы. Также продемонстрировано, что повышение экспрессии CSPG4/NG2 в опухолях с плохим прогнозом положительно коррелирует (коэффициент Пирсона 0,9514) с увеличением уровня маркера раковых стволовых клеток CD44 в тех же клинических образцах.

Выводы

Полученные данные демонстрируют перспективу использования CSPG4/NG2 для определения оптимального постоперационного лечения пациентов с глиобластомой.

Глиобластома – наиболее злокачественная из глиальных опухолей головного мозга со средней продолжительностью жизни после оперативного лечения 4–12 мес. [1, 4]. В злокачественных опухолях головного мозга происходит изменение экспрессии большого числа генов. Ранее исследователи продемонстрировали использование CSPG4/NG2 для прогноза течения заболевания других видов злокачественных новообразований. Установлено, что CSPG4/NG2 ассоциирован с плохим прогнозом острого миелоидного лейкоза [5], рака молочной железы [3] и меланомы [7]. Однако для опухолей мозга этот вопрос остается малоизученным.

Для различных видов рака известно, что агрессивность опухоли зачастую определяется содержанием в ее составе опухолевых стволовых клеток. Авторы высказывали гипотезу, что и для глиобластом повышенная агрессивность также может быть связана с содержанием стволовых клеток в опухоли [6]. Известный молекулярный маркер стволовых клеток различных опухолей – хондроитинсульфат протеогликан CD44 – рецептор

Таблица 1 Праймеры, использованные для полимеразной цепной реакции

Ген Последовательность Температура плавления, °C F 5’-TATGTTGGCCAGACTTGCAT-3’ 59 CSPG4/NG2 R 5’-TGCAGGTCTATGTCGGTCAG-3’ 59 F 5’-GACAAGTTTTGGTGGCACG-3’ 59 CD44 R 5’-CACGTGGAATACACCTGCAA-3’ 59 F 5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’ 59 GAPDH R 5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3’ 59 гиалуроновой кислоты, а также, возможно, некоторых других лигандов. Поэтому определение уровня CD44 может характеризовать содержание стволовых клеток в конкретной опухоли.

Целью исследования являлось изучение уровня экспрессии гена CSPG4/NG2 в глиобластоме на транскрипционном уровне, его взаимосвязи с содержанием CD44 , тяжестью течения заболевания и возможности использования в качестве прогностического маркера для оптимизации послеоперационного лечения пациентов с такой патологией.

Материал и методы

В центре ангионеврологии и нейрохирургии фгбу «Новосибирский научно-исследовательский институт имени академика Е.Н. Мешалкина» Минздрава России прооперировали 8 пациентов по поводу глиобластомы головного мозга – Gr.4. Пациентов разделили на две группы по показателю постоперационной выживаемости: 5 пациентов (группа 1) – выживаемость менее 1 года и 3 пациента (группа 2) с выживаемостью более 1 года после удаления опухоли [4]. От каждого пациента получено по одному образцу ткани опухоли. Образцы фиксировали в растворе RNA-later (LifeTechnologies, США) согласно инструкции производителя и хранили при температуре –20 °C.

Для выделения суммарной РНК образцы замораживали в жидком азоте и гомогенизировали. Выделение РНК проводили с использованием реагента TRIzol (LifeTechnologies, США) с дальнейшей дополнительной очисткой с помощью набора PureLink (Invitrogen, США) согласно прилагаемому протоколу. кДНК получали из 1–2 мкг РНК при помощи First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, США) и в дальнейшем анализировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для ПЦР использовали праймеры, представленные в табл. 1.

Количественную ПЦР в реальном времени с использованием красителя SYBR Green I (Biolink, Москва) и Taq-полимеразы (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск) проводили при помощи амплификатора CFX96 (BioRad, США) в режиме: 3 мин 95 °C, 20 с 95 °C, 15 с 59 °C, 50 с 72 °C. Общий объем реакции составил 25 мкл. Амплификацию проводили в течение 40 циклов. В качестве контрольного гена выбрали ген GAPDH. Продукты ПЦР проверяли на специфичность методом кривой плавления. Анализ результатов проводили методом определения относительной экспрессии с использованием программного обеспечения Origin 8.5 (OriginLab, США).

Статистический анализ

Данные экспрессии генов представляли как среднее арифметическое и стандартное отклонение. Различия

Таблица 2 Характеристика образцов глиобластом

Образец	Пол	Возраст, лет	Клинический диагноз	Длительность жизни после операции, мес.
GB17	Ж	57		4
GB18	М	55		13
GB36	М	52		36
GB37	Ж	36	Глиобластома	13
GB40	М	28		7
GB43	М	42		9
GB45	М	53		8
GB46	Ж	53		10

Относительная экспрессия CSPG4/NG2 и CD44 в клинических образцах глиобластомы сравниваемых параметров считали значимыми, если вероятность ошибки р была меньше 0,05. Для оценки корреляции уровня экспрессии генов использовали коэффициент Пирсона. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Origin 8.5 (OriginLab, США).

Результаты

С учетом катамнеза заболевания пациентов образцы опухоли разделили на две группы. В первую группу вошли образцы глиобластом пациентов с выживаемостью менее 1 года после операции, во вторую – более 1 года (табл. 2).

При помощи метода ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием GAPDH в качестве контрольного гена оценивали уровень экспрессии CSPG4/NG2 в клинических образцах глиобластомы пациентов с различной выживаемостью после операции ( рисунок ).

Обнаружено, что уровень экспрессии CSPG4/NG2 достоверно различается в группах пациентов с выживаемостью до года и после и составляет 27,1±4,8 и 6,0±1,1. Такая ассоциация уровня экспрессии CSPG4/NG2 с выживаемостью пациентов позволяет предположить о возможности его использования в качестве прогностического маркера агрессивности опухолей головного мозга.

Уровень экспрессии CD44 , определенный в тех же образцах опухолей, для которых проанализировали экспрессию CSPG4/NG2 , показан на рисунке. В опухолях пациентов с выживаемостью до года уровень экспрессии CD44 выше по сравнению с опухолями пациентов с выживаемостью более 1 года и составляет 26,1±5,1 и 7,3±1,9. Это коррелирует с экспрессией CSPG4/NG2 в этих же клинических образцах (коэффициент Пирсона

0,9514) и подтверждает высказанное предположение, что низкая выживаемость может быть связана с высоким содержанием стволовых клеток, экспрессирующих CSPG4/NG2 и CD44 .

Обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о достоверной разнице в уровне экспрессии CSPG4/NG2 в глиобластомах пациентов с продолжительностью жизни после операции до года и более. Аналогичные показатели получили авторы, показавшие, что высокий уровень CSPG4/NG2 играет роль в пролиферации опухолевых клеток глиобластомы [8]. На фоне повышения экспрессии этого гена также происходит усиление пролиферативной активности элементов сосудистого русла опухоли, уровень которой характеризует степень ее агрессивности, что было показано при совместном изучении ангиогенеза в глиобластомах и меланомах на доклинических моделях [10].

Авторы немногочисленных работ показали, что повышенное содержание CSPG4/NG2 в опухоли способно приводить к возникновению лекарственной устойчивости [2] или устойчивости к радиотерапии [9]. В исследовании мы продемонстрировали повышение в опухолях пациентов с плохим прогнозом выживаемости уровня хондроитинсульфат протеогликана CD44 – маркера стволовых клеток. При различных видах рака агрессивность опухоли зачастую определяется содержанием в ее составе стволовых клеток [6], поэтому увеличение экспрессии CD44 также может быть сопряжено с высокой толерантностью глиобластом к химио- и радиотерапии.

В совокупности полученные результаты открывают перспективу для использования CSPG4/NG2 как прогностического маркера при выборе стратегии постоперационного лечения пациентов. В частности, могут быть пересмотрены очередность применения методов химио- и радиотерапии, а также соотношение времени их воздействия и дозы под контролем возможного рецидива методами нейровизуализации.

Несомненно, конкретные предложения могут быть сформулированы только после проведения дополнительных уточняющих исследований с привлечением иммуногистохимических методов и распространения данного подхода на другие глиальные новообразования.

Заключение

Низкая выживаемость больных в постоперационном периоде может быть связана с повышенным уровнем экспрессии гена CSPG4/NG2 и высоким содержанием в опухоли стволовых клеток, экспрессирующих CSPG4/NG2 и CD44 .

Оценки экспрессии гена CSPG4/NG2 в качестве прогностического маркера агрессивности опухоли в стандартную процедуру гистоморфологического анализа глиальных новообразований позволит оптимизировать ведение пациентов с глиобластомой в постоперационном периоде.