Транскрипционная активность генов клеточного цикла и апоптоза у хронически облучённых лиц, имеющих повышенную частоту TCR-мутантных лимфоцитов

Одним из чувствительных индикаторов воздействия ионизирующего излучения является оценка мутабильности соматических клеток, в частности, регистрация TCR-мутантных лимфоцитов. В ряде работ показано, что даже в отдалённые сроки после облучения у некоторых лиц регистрируется повышенная частота клеток с мутациями в генах Т-клеточного рецептора. Так, у ликвидаторов ЧАЭС уровень TCR мутаций повышен в 2-3 раза по сравнению с необлучёнными людьми. Примечательно, что через 9-17 лет после аварии их частота снижалась до фоновых значений у большинства облучённых людей, однако у 17% лиц частота клеток с мутациями по TCR-локусу продолжала оставаться значимо повышенной [1]. Аналогичные результаты отмечались спустя 40 лет после начала облучения у людей, проживающих рядом с Семипалатинским ядерным полигоном [2], и спустя 60 лет у жителей прибрежных сёл реки Течи [3]. Эти исследования свидетельствуют о том, что образование соматических мутаций может быть обусловлено возникновением радиационно-индуцированной нестабильности генома у некоторых облучённых лиц, которая способна проявляться в отдалённом периоде после радиационного воздействия.

Исследования транскрипционной активности генов, регулирующих защитные механизмы клетки у людей с повышенной частотой TCR-мутантных клеток, позволят дополнить знания о механизмах радиационно-индуцированного мутагенеза в лимфоцитах периферической крови. Основываясь на некоторых литературных данных о степени эффективности репарационных процессов ДНК [4] и частоте апоптотической гибели клеток [5] у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в отдалённые сроки, можно предположить, что одной из причин таких изменений является аберрантная активность некоторых генов.

В связи с этим, целью данного исследования явилось изучение уровня мРНК генов ATM, TP53, MDM2, CDKN1A, BCL-2 и BAX у жителей прибрежных сёл реки Течи, имеющих повышенный уровень мутаций в генах Т-клеточного рецептора лимфоцитов.

Материалы и методы

Исследования проводили у 309 жителей прибрежных сёл реки Течи, имеющих реконструированную дозу облучения красного костного мозга (ККМ) по дозиметрической системе TRDS (Techa River Dosimetry System, версия 2016) [6]. В группу облучённых лиц вошли 163 человека, кумулятивные дозы облучения ККМ которых находились в диапазоне от 80 до 3510 мЗв (720 ± 60 мЗв). Следует отметить, что образцы были получены через 60-70 лет после начала хронического радиационного воздействия. Контрольная группа включала 146 человек, проживающих в тех же населённых пунктах (в сходных социально-экономических условиях), но с интенсивностью облучения ККМ, не превышавшей 1 мЗв/год, и накопленной дозой менее 70 мЗв за весь период своей жизни.

Группы были сопоставимы по полу и состояли из двух этнических групп: 1 – тюрки, в основном татары, а также башкиры; 2 – славяне, в основном русские, а также украинцы и белорусы. Характеристика обследованных лиц представлена в табл. 1.

Таблица 1 Общая характеристика обследованных лиц по возрасту, полу и этническому фактору

Характеристика групп	Облучённые	Группа сравнения
Число обследованных лиц	163	146
Возраст на время обследования, лет M±SE (диапазон)	70,92±5,59 (60-87)	62,4±6,43 (57-81)
Пол, %                     Мужчины Женщины	38,6 (63)* 61,4 (100)	30,8 (45) 69,2 (101)
Славяне Этническая группа, %	52,8 (86) 47,2 (77)	66,4 (97) 33,6 (49)

Примечание: * – число обследованных лиц.

В соответствии с действующими международными нормами (Хельсинкская декларация 1964 г.) и с разрешения этического комитета ФГБУН УНПЦ РМ у всех пациентов, принимавших участие в данном исследовании, было получено информированное согласие на взятие образца крови и проведение дальнейшего исследования.

В связи с тем, что наличие заболеваний и других факторов, сопровождающих человека на протяжении его жизни, могут оказывать влияние на паттерн экспрессии генов, был разработан ряд критериев исключения из исследования. Из выборки были исключены пациенты, имеющие онкологические и хронические заболевания в фазе обострения, принимающие цитостати- ческие и гормональные препараты, антибиотики, имеющие или имевшие ранее контакт с вредными генотоксическими (химическими и биологическими) агентами в процессе профессиональной деятельности, а также проходившие медицинское диагностическое облучение в течение 6 предшествующих месяцев до момента взятия крови для обследования.

Определения частоты клеток с мутациями Т-клеточного рецептора . Анализ мутации Т-клеточного рецептора в лимфоцитах периферической крови проводился методом проточной цитофлуориметрии [7, 8] с некоторыми модификациями. Лимфоциты периферической крови человека, выделенные на градиенте плотности фиколл-урографина. После отмывки клетки распределяли по 100 мкл в пробирки, содержащие 10 мкл моноклональных антител CD3-FITC/CD4-PE и 10 мкл моноклональных антител IgG1-PE/ IgG1-FITC (BeckmanCoulter, США), выступающих в качестве изотопического контроля. Клетки, попадающие в область негативных клеток по экспрессии CD3-комплекса, относились к мутантным по генам TCR.

Определение транскрипционной активности генов . Для исследования содержания мРНК генов ATM, MDM2, TP53, CDKN1A, BCL-2 и BAX, тотальную РНК экстрагировали колоночным методом с использованием набора Tempus™ Spin RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом фирмы производителя. Количественную и качественную оценку полученных образцов РНК проверяли с помощью спектрофотометра NanoDrop2000 (Thermo Scientific, США). Соотношение оптических плотностей, измеренных при 260 и 280 нм (A260/A280), для очищенной РНК, выделенной из всех образцов, составляло 2,01 ± 0,05. Реакции обратной транскрипции для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) проводили с использованием коммерческого набора реактивов (OOO «ТестГен», Россия), содержащего обратную транскриптазу MMLV и случайные гексануклеотидные праймеры, согласно протоколу фирмы производителя. Полученные образцы кДНК использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР в реальном времени.

Таблица 2

Информация о праймерах, использованных в работе

Ген		Локализация	Tm	GC, %	Размер продукта	Ссылки на мишени (транскрипты) из ресурса NCBI
ATM	F R Probe	Ex15-ex16 Ex16-ex17 Ex16	60,16 58,61 57,43	45,45 36,00 50,00	130	NM_000051.3
TP53	F R Probe	Ex8-ex 9 Ex10- ex11 Ex10	61,08 60,04 59,89	60,00 60,00 70,00	206	NM_001126112.2
MDM2	F R Probe	Ex8 Ex10- ex11 Ex10	59,86 59,12 58,61	57,89 41,67 54,17	271	NM_002392.5
CDKN1A	F R Probe	Ex3 Ex3-ex4 Ex3	59,31 59,61 59,98	55,00 45,83 65,00	140	NM_001291549.1
BCL-2	F R Probe	Ex2 Ex3 Ex3	60,11 60,96 59,69	60,00 60,00 65,00	143	NM_000633.2
BAX	F R Probe	Ex4-ex5 Ex5 Ex5	61,81 60,03 59,12	60,00 55,00 60,00	73	NM_017027077.1
COMT	F R Probe	Ex2-ex3 Ex3-ex4 Ex3	59,93 59,64 59,97	57,89 61,11 70,00	162	NM_007310.2

Примечание: Ex-ex – экзон-экзонный переход; Ex – экзон.

Для анализа содержания мРНК исследуемых генов применяли метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-ВР) с использованием тест-систем фирмы ООО «Тест-Ген» (Россия). Следует отметить, что принцип действия тест-системы аналогичен технологии разрушаемых олигонуклеотидных проб «TaqMan»®. Информация о праймерах и зондах представлена в табл. 2.

Для получения достоверных результатов каждую реакцию проводили в трёх повторах с использованием отрицательного контроля на амплификаторе Real-time CFX96 Touch (BioRad, США). Температурный режим: 1 цикл предварительная денатурация 95 °С/10 мин, далее 50 циклов: 94 °С/10 с, 65 °С/50 c. Данные анализировали с использованием метода 2-ΔΔCt [9] с нормализацией по экспрессии гена «домашнего хозяйства» COMT в каждом образце.

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя программное обеспечение Statistica 10.0, SPSS. Предварительный анализ с помощью теста Колмогорова-Смирнова в большинстве случаев демонстрировал несоответствие распределений этих показателей нормальному закону, в связи с чем применялся непараметрический U-тест Манна-Уитни. Связь показателей экспрессии генов с накопленной дозой облучения и уровнем ТCR-мутантных лимфоцитов проводили методом корреляционного анализа по Спирману. При оценке достоверности результатов был принят 5% уровень значимости.

Результаты и обсуждение

При анализе содержания мРНК исследуемых генов были выявлены статистически значимые отличия для генов BCL-2 и BAX (табл. 3). Так, в группе облучённых лиц относительное содержание мРНК гена BCL-2 было значимо снижено (p=0,003), в то время как количество транскриптов гена BAX повышено (p=0,012) относительно группы сравнения.

Таблица 3 Содержание мРНК исследуемых генов в клетках периферической крови у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию

Ген	Группа сравнения медиана (25-75%)	Облучённые люди медиана (25-75%)
ATM	0,99 (0,86-1,20)	0,96 (0,85-1,12)
TP53	1,09 (0,89-1,28)	1,06 (0,85-1,27)
MDM2	1,05 (0,78-1,39)	0,95 (0,77-1,24)
CDKN1A	0,88 (0,76-1,01)	0,92 (0,75-1,14)
BAX	1,09 (0,86-1,44)	1,26* (1,04-1,39); p=0,012
BCL-2	1,07 (0,71-1,43)	0,91* (0,67-1,11); p=0,003

Примечание: * – достоверное различие по критерию Манна-Уитни для двух независимых выборок; p – значимые различия с группой сравнения.

Полученные результаты свидетельствуют об изменении состояния внутриклеточных защитных механизмов, в частности, активации процесса апоптоза клеток у хронически облучённых индивидуумов. В связи с тем, что изменение экспрессии генов на транскрипционном уровне не всегда отражает процессы, регулируемые на белковом уровне, наши данные могут только косвенно подтверждать гипотезу о повышении частоты апоптоза лимфоцитов периферической крови (ЛПК) в отдалённые сроки у облучённых людей [5, 10]. Тем не менее, ранее нами было показано, что у жителей прибрежных сёл реки Течи прослеживается статистически значимое повышение исходного уровня апоптоза на ранней стадии по сравнению с необлучённым контролем [11].

Поскольку в условиях радиационного воздействия апоптотические гены демонстрируют изменение своей активности, которая, как правило, пропорциональна дозе облучения [12-14], облучённые лица, принимавшие участие в обследовании, были поделены на три дозовых подгруппы (облучённые в диапазоне средних (100-490 мЗв и 500-990 мЗв) и высоких доз (превышающих 1000 мЗв)).

Примечательно, что экспрессия гена BCL-2 была снижена у лиц, имеющих промежуточные значения доз облучения ККМ от 100 до 490 мЗв (p=0,002). В то время как активность гена BAX была статистически значимо повышена у людей с кумулятивными дозами облучения ККМ, превышающими 500 мЗв, что согласуется с результатами других исследований. M. Katsura et al. [15] показывают, что порог, при котором регистрируется модуляция экспрессии апоптотических генов, также находится в диапазоне средних и высоких доз (более 500 мЗв (0,11 мЗв/мин)). В свою очередь, I.N. Ilienko et al. [16] описывают дозозависимую дерегуляцию процесса апоптоза на уровне транскрипции для генов TP53, BAX и FasL, указывая на разницу в экспрессии этих генов у лиц с поглощёнными дозами более 500 мГр.

Таблица 4

Содержание мРНК исследуемых генов в подгруппах лиц, имеющих разные накопленные дозы облучения ККМ

Наименование гена	Дозовые подгруппы
	< 70 мЗв медиана (25-75%) N=146	100-490 мЗв медиана (25-75%) N=78	500-990 мЗв медиана (25-75%) N=49	>1000 мЗв медиана (25-75%) N=36
ATM	0,99 (0,86-1,20)	0,97 (0,88-1,16)	0,98 (0,84-1,19)	0,93* (0,84-1,07); p1=0,05
TP53	1,10 (0,89-1,28)	1,09 (0,96-1,26)	1,03 (0,76-1,29)	1,07 (0,79-1,30)
MDM2	1,05 (0,78-1,39)	1,01 (0,75-1,32)	0,92 (0,81-1,20)	0,88 (0,74-1,05)
CDKN1A	0,98 (0,76-1,21)	0,97 (0,81-1,16)	0,97 (0,73-1,16)	0,79* (0,71-0,97); p2=0,01
BAX	1,09 (0,86-1,44)	1,18 (0,92-1,40)	1,27* (1,09-1,41); p1=0,01	1,25* (1,10-1,38); p1=0,03
BCL-2	1,07 (0,71-1,42)	0,88* (0,68-1,08); p1=0,002	0,84 (0,71-1,17)	0,98 (0,74-1,14)

Примечание: * – достоверное различие по критерию Манна-Уитни для двух независимых выборок; p1 – статистически значимые различия с группой сравнения (дозы облучения ККМ до 70 мГр); p2 – статистически значимые различия с подгруппой облучённых лиц, имеющих кумулятивные дозы облучения ККМ 80-490 мЗв.

При сравнении разных дозовых подгрупп мы отмечаем, что для жителей прибрежных сёл реки Течи с кумулятивными дозами облучения ККМ, превышающими 1000 мЗв, характерно достоверно низкое содержание мРНК генов ATM (p=0,05) и CDKN1A (p=0,01) по сравнению с контрольной группой (табл. 4). При этом, согласно результатам корреляционного анализа, в группе облучённых людей обнаружены статистически значимые слабые отрицательные корреляционные связи содержания мРНК гена CDKN1A (S=-0,19; p=0,02) и ATM (S=-0,16; p=0,05) от поглощённой дозы облучения ККМ (табл. 5).

Таблица 5

Коэффициенты корреляции содержания мРНК исследуемых генов и дозы облучения ККМ

Ген	Кумулятивная доза облучения ККМ
TP53 ATM MDM2 CDKN1A BCL-2 BAX	-0,07R; p=0,41 -0,16*; p=0,05 -0,02; p=0,75 -0,19*; p=0,02 0,13;p=0,12 0,09; p=0,26

Примечание: R – коэффициент ранговой корреляции Спирмена; * – статистически значимые коэффициенты корреляции.

Полученные данные являются крайне важными, поскольку продукты генов ATM и CDKN1A играют центральную роль в реализации ответа клетки на повреждение клеточных структур [17]. Помимо того, что они способны регулировать остановку клеточного цикла с целью предотвращения процессинга повреждённой ДНК, они активируют сигнальные внутриклеточные пути, индуцируя апоптоз, в случае неточной или невозможной репарации ДНК [18].

Согласно результатам последних исследований дисфункция гена ATM является причиной развития нестабильности генома, которая проявляется в увеличении частоты хромосомных аберраций (ХА) и генных мутаций [19]. Так, периферические лимфоциты с пониженной экспрессией ATM демонстрируют хромосомные аномалии, которые преимущественно включают хромосомные точки разрыва в генах TCR, главным образом в 14q11 (TCRa и δ), 7q14 (TCRy) и 7q35 (TCRß) [20]. В свою очередь, доказано, что потеря функции CDKN1A приводит к избыточной дублированности центриолей и образует аберрантное число центросом, нарушая тем самым процесс формирования веретена деления [21], что может являться одной из причин повышения частоты клеток с блоком клеточного цикла, который ранее был зафиксирован у некоторых жителей прибрежных сёл реки Течи [22].

Основываясь на положении, что повышенная частота мутантных клеток в отдалённые сроки после облучения может быть обусловлена нарушением репарационных механизмов и элиминации клеток с повреждённой ДНК, нами был проведён анализ содержания мРНК исследуемых генов у облучённых лиц с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов.

Облучённые лица были разделены по принципу превышения критического значения TCR-мутантных Т-лимфоцитов в крови, который был рассчитан в группе сравнения по формуле 1:

TCR =

Z⁽ x i - x ) n - 1

где

Z x

n

– среднее значение частоты TCR-мутантных клеток;

– стандартное

отклонение.

Среднее значение частоты TCR-мутантных клеток в группе необлучённых людей равнялось 0,1%, стандартное отклонение составило 0,11. Таким образом, критическое значение для формирования группы лиц с повышенным уровнем TCR-мутантных лимфоцитов составило: 0,1 ± 2 x 0,11=0,32%. Лица, у которых наблюдалось значение выше 0,32%, попадали в группу людей с повышенным уровнем TCR-мутантных клеток. Характеристика исследуемых групп представлена в табл. 6.

Таблица 6

Характеристика облучённых лиц с нормальной и повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов и группы сравнения

Показатели M±SE (диапазон)	Группы
	группа сравнения	облучённые лица с нормальной частотой TCR-мутантных лимфоцитов	облучённые лица с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов
Число обследованных лиц Возраст на время проведения обследования, лет Кумулятивная доза облучения ККМ, мЗв Частота TCR-мутантных клеток, %	24 65,2±1,8 (56-81)1 20±4 (0-50)2 0,11±0,02 (0,01-0,25)3	25 72,7±1,4 (62-87) 700±90 (90-1870) 0,14±0,02 (0,01-0,30)	16 71,5±1,4 (63-81) 760±130 (100-1760) 0,79±0,11 (0,33-1,75)

Примечание: ККМ – красный костный мозг; 1 – возрастной диапазон; 2 – диапазон индивидуальных значений доз; 3 – диапазон частоты TCR-мутантных клеток.

Несмотря на то, что мы не обнаружили статистически значимых корреляционных связей между содержанием мРНК исследуемых генов и частотой клеток с мутациями в генах T-клеточного рецептора, мы отмечаем снижение содержания мРНК гена BCL-2 (медиана 0,65 отн. ед.) в группе облучённых лиц с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов по сравнению с контрольной группой (медиана 0,89 отн. ед., p=0,05) и группой облучённых лиц, имеющих нормальную частоту TCR-мутаций (медиана 0,86 отн ед., p=0,047) (рис. 1А). Более того, у облучённых людей с повышенной частотой TCR-мутантных клеток также отмечалась тенденция к повышению содержания мРНК гена BAX (1,29 отн. ед.) по сравнению с контрольной группой (1,14 отн. ед., p=0,09) (рис. 1 Б).

Рис. 1. Содержание мРНК гена BCL-2 (А) и

BAX (Б) у облучённых лиц с нормальной и повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов.

Доказано, что клетки, лишённые экспрессии комплекса TCR/CD3 на своей поверхности, подвергаются моментальному апоптозу [23]. Наши данные, в какой-то степени, согласуются с текущими представлениями активации механизма гибели клеток, несущих потенциально опасные структурные нарушения ДНК. Несмотря на это, в отдалённые сроки у части облучённых лиц сохраняется повышенная частота TCR-мутантных лимфоцитов, что свидетельствует о нарушении механизма их элиминации.

Примечательно то, что при исследовании медико-биологических последствий хронического радиационного воздействия у жителей прибрежных сёл реки Течи было показано линейное увеличение TCR-мутантных лимфоцитов у лиц, имеющих кумулятивные дозы облучения ККМ в диапазоне от 200 до 1000 мЗв, с последующим выходом на плато в диапазоне доз от 1000 до 1500 мЗв [11]. В рамках нашего исследования мы отмечаем, что модуляция активности апопто-тических генов также регистрируется в диапазоне доз, имеющих промежуточные и высокие значения (более 500 мЗв).

Равновесие между экспрессией генов апоптоза является одним из факторов, определяющих восприимчивость клеток к действию генотоксического агента. Нарушение этого баланса лежит в основе развития воспалительных реакций и является серьёзным препятствием для эффективного лечения. Мы предполагаем, что изменение экспрессии генов BCl-2 и BAX может приводить к активации апоптотической гибели клеток в отдалённые сроки после облучения.

Таким образом, результаты, полученные в ходе исследования, могут свидетельствовать о сложном системном ответе облучённого организма со стороны модификации его транскриптома, затрагивая в большей степени гены, принимающие участие в поддержании гомеостаза клетки.

Выводы

• 1.    В отдалённые сроки (спустя более 60 лет) после начала хронического радиационного воздействия у жителей прибрежных сёл реки Течи (диапазон доз облучения ККМ от 80 до 3500 мЗв) показана аберрантная экспрессия апоптотических генов. Отмечено статистически значимое снижение уровня мРНК гена BCL-2 и увеличение уровня мРНК гена BAX.

• 2.    У лиц с кумулятивными дозами облучения ККМ, превышающими 1000 мЗв, отмечено достоверно низкое содержание мРНК генов ATM и CDKN1A.

• 3.    У облучённых лиц, имеющих повышенную частоту TCR-мутантных лимфоцитов, наблюдается достоверно пониженное содержание мРНК гена BCL-2.