Трехмерная визуализация и анализ пролиферативной активности в гиппокампе взрослых мышей

НИИ НФ им. П.К.Анохина РАМН, г. Москва, Россия

МФТИ, г. Долгопрудный, Россия

Рождение новых нейронов из стволовых клеток в мозге взрослых животных (в частности, в гиппокампе) связано с важнейшими когнитивными функциями [4]. Этот процесс отличается динамичностью, и число новых нейронов и делящихся клеток может изменяться в ответ на различные стимулы [1-3]. Обычно оценка нейрогенеза производится на выборочных срезах с последующей экстраполяцией числа клеток к общему объему гиппокампа (или другой изучаемой области мозга). Возможность визуализации стволовых и делящихся клеток в целых структурах мозга могла бы резко увеличить точность и производительность анализа нейрогенеза, а также наглядно увидеть его скрытые функциональные паттерны. В связи с этим, целью данной работы была разработка методик выявления пролиферирующих клеток в целом гиппокампе взрослых мышей методом клик-реакции и подсчета делящихся клеток в трехмерном изображении, а также применение разработанных методик для подсчета количества новообразованных клеток в гиппокампах мышей, подвергшихся радиационному облучению.

Работу проводили на самцах трансгенных мышей линии Nestin-CFPnuc в возрасте 60 суток. Животные одной из групп были подвергнуты облучению быстрыми нейтронами в дозе 0,34 Гр (группа Обл). Облучение осуществляли на циклотроне НИЦ Курчатовский институт (бериллиевая мишень, энергия протонов 32 МэВ). Животные из группы ложное облучение (ЛОбл) проходили через все процедуры, что и мыши группы Обл, но не подвергались воздействию ионизирующего излучения. Мышей наркотизировали, перфузировали и декапитировали через 24 ч после облучения. За 2 ч до перфузии всем животным вводили синтетический аналог тимидина EdU (5'-этинил-2'-дезоксиуридин) в дозе 123 мг/кг. Левые половины мозга были подвергнуты флуоресцентному маркированию пролиферирующих клеток в целых гиппокампах (n=11), правые – флуоресцентному маркированию пролиферирующих клеток на серийных срезах (n=13). Делящиеся клетки выявляли с помощью клик-реакции азидом, конъюгированным с флуорофором AlexaFluor555. Визуализацию целых образцов гиппокампа осуществляли с помощью лазерного сканирующего микроскопа Olympus FV1000. Съемку производили на всю глубину (до 1,5 мм) с шагом 5 мкм, сшивали 25-35 полей зрения (при 20х увеличении). На основе полученных изображений строили 3D-реконструкции, в которых создавали искусственные поверхности зубчатой извилины и осуществляли количественный подсчет меток в программе Imaris Bitplane.

Была разработана методика выявления пролиферирующих клеток в целых структурах головного мозга животных. Показано, что с помощью клик-реакции возмож- на визуализация делящихся стволовых и прогениторных клеток в отделах мозга толщиной до 1 мм, тем самым делая возможным анализ нейрогенеза в целом гиппокампе. Получаемые трехмерные изображения позволяют осуществлять на них автоматический подсчет количества меченых клеток. Сравнение числа пролиферирующих клеток на серийных срезах и целых объемных препаратах с помощью автоматического подсчета показало полное совпадение количественных оценок. Число делящихся клеток, подсчитанных в целых гиппокампах и на серийных срезах составляло: 1611±175 и 1682±342 для ЛОбл; 402±51 и 445±110 для Обл, соответственно. Расхождение было незначительным и составляло не более 8-9%. Сравнение количества клеток у ложнооблученных мышей и животных, облученных (Обл) быстрыми нейтронами и гамма-квантами, выявило значительное (на 75%) снижение количества делящихся клеток в зубчатой фасции гиппокампа взрослых мышей. Таким образом, разработанные методы позволяют использовать их для количественной оценки нейрогенеза в гиппокампе мозга взрослых мышей, а также могут быть применимы для широкого спектра различных задач, требующих количественной оценки.

Работа выполнена при поддержке гранта Правительства РФ №11.G34.31.0071 от 21.10.2011 г.