Участие цитокинина и ауксина в регулировании процесса накопления в бобовых

Фитогормоны (ауксины, цитокинины, гиббереллины, брассиностероиды, абсцизовая кислота, этилен, жасмоновая кислота и ряд других), играют определяющую роль в процессах жизнедеятельности растений, оказывая многостороннее влияние на рост и развитие растений (Kulaeva,1973; Кеfeli, 1974; Polevoy, 1982; Gamburg et al.,1990). Из них наибольшее внимание в научном и практическом аспекте уделяется ауксинам и цитокининам. Соединения, обладающие ауксиновой активностью, стимулируют растяжение клеток. Цитокинины оказывают влияние на деление клеток.

В настоящее время известно 6 групп соединений, обладающих ауксиновой активностью. Среди них наиболее изученными являются природный ауксин - индолил-3-уксусная кислота (ИУК) и синтетические ауксины -индолилмасляная, нафтилуксусная и 2,4-дихлорфеноксиуксусная (2,4-Д) кислоты. Ауксины синтезируемые в тканях апекса надземных органов транспортируются по флоеме активно и полярно в апекс корня. Их действие связано с растяжением и размножением меристематических клеток, а также с явлением апикального доминирования, в результате которого верхушечная почка доминирует в росте, а рост боковых почек ингибируется.

Цитокинины обнаружены в клетках различных организмов. За способность индуцировать деление клеток растений (цитокинез) эти природные и искусственно синтезированные соединения получили название цитокининов. В настоящее время известно около 200 таких соединений как природного, так и синтетического происхождения. Наиболее известные из них: 6-фурфуриламинопурин (кинетин), зеатин, 6-бензиламинопурин (БАП). Цитокинины синтезируются в апексе корня и транспортируются в корне по ксилеме неполярно и пассивно снизу вверх. Они снимают ауксиновое апикальное доминирование, вызывая развитие стеблевых почек и ветвление побегов.

Цитокинины в комбинации с ауксином осуществляют переход клеточного деления к дифференцировке. Обнаружен антагонистический эффект действия ауксина и цитокинина на рост и органогенез в культуре тканей растений (Skoog, Miller, 1957). Этот антагонизм проявляется и при апикальном доминировании. В течение инициации и поддержания корневой апикальной меристемы цитокинины и ауксины функционируют как антагонисты, действуя в различных зонах меристемы (Moubayidin et al., 2009). Так, ауксин накапливается в кончике корня апикальной меристемы и поддерживает деление клеток, в то время как цитокинин действует между проксимальной меристемой и зоной растяжения и связан с переходом клеток от деления к дифференцировке (Moubayidin et al., 2009). Однако не исключено, что в других случаях эти гормоны могут действовать синергически, усиливая эффект каждого из них при определенной концентрации и соотношении.

Цитокинины являются сигнальными молекулами, инициирующие экспрессию соответствующих генов. У арабидопсиса цитокининовый сигналинг представлен двумя компонентами – рецептором гистидинкиназой (например, MtCRE1) и ответным генным регулятором ARR (cytokinin-responsive Arabidopsis response regulator) (Ferreira, Kieber, 2005). Цитокинины подавляют формирование латеральных корней, но индуцируют морфогенез корневого клубенька и образование галлов при действии нематод (Lohar et al., 2004). Найдено, что размер корневой апикальной меристемы увеличивается у тройного мутанта арабидопсиса по ферментам синтеза цитокининов (изопентенилтрансферазы) (Ioio et al ., 2007). Эти растения (мутанты) показывают одновременно и уменьшение скорости дифференциации меристематических клеток, что свидетельствует о регуляции цитокинином этого процесса путем ограничения зоны корневой меристемы.

Таким образом, цитокинины регулируют рост и обеспечивают образование новых структур и их форму. Появление примордиев – зачатков органов, как и в случае морфогенеза корневого клубенька, происходит под влиянием цитокининов. Трансгенные растения с суперэкспрессией гена цитокининоксидаза/дегидрогеназа имели наименьшее содержание цитокинина и образовывали различные фенотипы: с увеличенной корневой меристемой, ростом боковых корней на границе проксимальной и апикальной меристемы, увеличенным ветвлением корней и формированием придаточных корней (Werner et al., 2003). Клеточный цикл находится под влиянием обоих гормонов и относительное значение каждого из них и степень их взаимодействия - важные вопросы для исследователей.

На основании анализа литературных данных можно заключить об участии ауксинов и цитокининов в процессах формирования бобово-ризобиального симбиоза (БРС). Этот факт впервые был установлен в 1936 г. (Thimann, 1936). Широкие исследования в этой области были проведены в 90-годах 20-века (Hirsch, 1992; Hirsch, Fang, 1994; Hirsch et al., 1997; Cooper, Long, 1994 и др.), которые показали участие цитокинина и ауксина в инициации образования клубенька. Функциональная значимость фитогормонов в этом процессе различная (Oldroyd, Downie, 2008). Если ауксины, цитокинины, а также гиббереллины и брассиностероиды, относятся к положительным регуляторам БРС, то другие – абсцизовая, жасмоновая, салициловая кислоты и этилен -негативные регуляторы симбиоза. Многочисленными исследованиями доказано участие ауксинов, цитокининов, гиббереллинов (ГБ) и брассиностероидов (БС) в инициации морфогенеза корневых клубеньков, а их уровень и соотношение являются ключевыми факторами в формировании клубеньков (Ferguson et al., 2005; Oldroyd, Downie, 2008).

Влияние ауксина и цитокинина на морфогенез корневых клубеньков

В настоящем кратком обзоре основное внимание будет уделено физиологическим аспектам действия цитокининов и ауксинов на процессы нодуляции (клубенькообразования) при формировании БРС, как наиболее изученной области проблемы мутуалистического симбиоза (Oldroyd et al., 2011; Murray, 2011). Одновременно будет рассмотрен вопрос о морфогенезе латеральных корней. Следует отметить, что результат действия фитогормонов зависит от их комбинаций и специфической роли каждого из них. Взаимодействие гормонов происходит на метаболическом уровне через их действие на определенный процесс или на уровне сигналинга (Ferreira, Kieber, 2005).

Отношение ауксин : цитокинин является важным для регуляции многих процессов роста и развития, включая регенерацию органа из культуры тканей (Skoog, Miller, 1957). Отличительной чертой цитокининов, в отличие от других гормонов, является экспрессия ими синтеза так называемых ранних белков – нодулинов, характерных для раннего этапа БРС: ENOD2, ENOD12, ENOD40 и др. (Bauer et al., 1996). Причем экспрессия генов-нодулинов под влиянием цитокининов происходит раньше, чем инициация образования примордия корневого клубенька (Hirsch, Fang, 1994). Вопрос принимают ли участие ранние белки-нодулины в органогенезе клубенька остается открытым. Есть мнение, что ранние нодулины могут быть индикаторами статуса эндогенного цитокинина в симбиотических тканях (Hirsch et al., 1997) и могут принимать участие (ENOD40) в регуляции деления клеток кортекса (Mathesius et al., 2000). Установлен факт, что под влиянием ризобий повышается содержание цитокининов и происходит экспрессия генов ENOD-белков. Это говорит о влиянии ризобий на синтез цитокининов и последующей экспрессии генов ENOD под влиянием цитокининов.

Ингибиторы транспорта ауксина известны как индукторы образования псевдоклубеньков и экспрессии ENOD40 – гена ассоциированного с инициацией образования примордия клубенька (Fang, Hirsch, 1998; Mathesius et al., 2000). Кроме того, транс-зеатин (цитокинин) способен активизировать нодуляцию у бобовых в опытах с ризобиями, мутантными по синтезу Nod-факторов (Cooper, Long, 1994). Таким образом, модуляция уровней ауксина и цитокинина – важный ключевой этап в формировании корневого клубенька. Важная роль цитокинина в нодуляции подтверждается генетическими исследованиями. Так, мутанты Lotus japonicus по самопроизвольной нодуляции несут мутацию по гистидинкиназе (LHK1) – рецептору цитокинина (Tirichine et al., 2007). Кроме того, потеря у мутанта люцерны функции CRE1 (ортолога LHK1) уменьшает в сильной степени образование клубеньков (Gonzalez-Rizzo et al., 2006). Lhk1-мутанты теряют способность образовывать примордии клубеньков, но не оказывают влияния на инфицирование корня ризобиями (Murray et al., 2007). Однако при этом показано влияние мутации на рост инфекционных нитей, которые создают сложные инфекционные структуры. Делается вывод, что формирование примордия клубенька не связано с проникновением (инфекцией) ризобий в ткани корня через эпидермис. В то же время экзогенный цитокинин индуцирует экспрессию генов, которые в норме ассоциированы с формированием примордия клубенька (Fang, Hirsh, 1998; Mathesius et al., 2003). Мутации по гену LHK1 указывают на центральную роль цитокининов в органогенезе клубенька в кортексе и одновременно свидетельствуют об отсутствии их влияния на ризобиальную инфекцию в эпидермисе.

Влияние фенольных соединений (флавоноидов) на органогенез клубенька

Известно, что флавоноиды бобовых вызывают экспрессию ризобиальных nod-генов, ведущих к синтезу бактериальных хитоолигосахаридных Nod-факторов, которые инициируют ответные реакции у растения-хозяина на внедрение ризобий (Mulligan, Long, 1989). Но на этом функции флавоноидов при формировании клубенька не заканчиваются: имеется достаточное количество литературных данных, указывающих на регуляцию (модуляцию) локального уровня ауксина в тканях корня, связанного с ингибированием флавоноидами белков - транспортеров ауксина (PINs и PGPs) (Zhang et al., 2009) и участием этих соединений и пероксидазы в распаде ауксина (ИУК) (Mathesius et al., 2001). PINs (PIN-formed auxin) – белки-транспортеры ауксина (семейство TC 2.A.69). Другое семейство белков-транспортеров ауксина PGPs (phosphoglycoproteins) (ТС 3.А.1), интегрированно в плазматическую мембрану. Предполагается, что флавоноиды модулируют транспорт ауксина путем изменения фосфорилирования белков - киназ и фосфолипидов (DeLong et al., 2002).

Одним из возможных механизмов при ризобиальной инфекции по индуцированию гормональных изменений в кортексе является локализация синтеза флавоноидов, которые могут ингибировать транспорт ауксина и таким образом изменять поток ауксина в корне (Mathesius, 2001). С 1988 года известно (Jacobs, Rubery,1988), что флавоноидные соединения (кварцетин, апигенин, кемферол и др.) могут блокировать полярный транспорт ауксина у растений, замещая функцию природного ингибитора транспорта ауксина NPA (1-naphthylphthalamic acid). Это позволяет в настоящее время рассматривать эндогенные растительные флавоноиды как природные регуляторы потока ауксина в клетках и полярного транспорта ауксина (Peer, Murphy, 2007; Adamowski, Friml, 2015). Ризобии через индукцию синтеза флавоноидов, могут также оказывать влияние на баланс цитокинины : ауксины в корневом кортексе. Главный источник цитокинина – меристематическая верхушка корня, в то время как источник ауксина - меристематическая верхушка стебля, и их потоки в корне -противоположные по направлению (Sakakibara, 2005; Leyser, 2006). Мутация по ферменту биосинтеза флавоноидов – халконсинтазе, ведет к ингибированию инициации образования примордия клубенька, что связывается с регуляцией флавоноидами потока ауксина в корне (Wasson et al., 2006). Флавоноиды скорее всего следует рассматривать как модуляторы транспортных процессов ауксина, чем как регуляторы (Peer, Murphy, 2007).

Механизмы влияния гормонов на органогенез клубенька и латеральных корней

Рассмотрим схему образования латеральных (боковых) корней и морфогенез клубенька на основе представлений о регуляции этих процессов цитокинином и ауксином. Инициация латеральных корней происходит в зоне дифференциации клеток на фоне высокого содержания ауксина в покоящем центре стволовых клеток (stem cells). Цитокининовый сигналинг, связанный с ингибированием транспортеров ауксина – PINs, PGPs, блокируется, что создает условия для транспорта ауксина в меристематическую верхушку корня и накопления ауксина в местах образования латеральных корней.

В случае ризобиальной инфекции основную роль играет Nod-фактор, активируемый растительными рецептор-подобными киназами. Установлено, что механизмы инициации органогенеза корневого клубенька основаны на регуляции потоков цитокинина и ауксина, в которых решающую роль принадлежит ризобиальным Nod-факторам (NF). Они представляют липохитоолигосахариды, которые взаимодействуют на плазмалемме эпидермальных клеток с растительными рецепторами (рецептор-подобными киназами, LysM-RLK, LRR-RLK) и инициируют активность сигнальных систем растения-хозяина (Глянько, 2015). Считается, что NF являются первоначальным триггером запуска физиологических, биохимических, генетических и других процессов, изменяющим направленность метаболизма растения-хозяина и ведущих к созданию симбиотрофного организма (Ferguson et al., 2010).

NF, локализованный на поверхности клеток эпидермиса, индуцирует транскрипционный фактор NIN (nodule inception) и запускает через активацию рецептора (гистидинкиназы) CRE1 -цитокининовый сигналинг. В результате блокируется транспорт ауксина через ингибирование транспортных белков (PINs, PGPs, NPA или флавоноидов) и ведет к накоплению цитокинина, инициирующего морфогенез клубенька. Схематически это можно представить следующим образом (схема 1).

• 1.    Ризобии (Rhizobia) → Nod - фактор (NF) → Рецепторые киназы (LysM-RLK / LRR-RLK) → Кальциевые осцилляции (Ca²⁺-spiking) → Кальций и кальмодулинзависимая киназа (CCaMK) → Транскрипционный белок (NIN) → Рецептор цитокинина (CRE1, LHK1) → Цитокининовый сигналинг (Cytokinin signaling) → Транскрипционные факторы (белки) нодуляционного сигнального пути 1 и 2 (NSP1/2) → Ингибирование полярного транспорта ауксина (Inhibition polar auxin transport —| PINs) → Высокая концентрация цитокинина/низкая концентрация ауксина (High cytokinin/Low auxin) → Деление кортикальных клеток, органогенез клубенька (Cortical cells division, organogenesis nodule).

• 2.    Ответные регуляторные гены ( RR7, RR15 ) → Цитокининовый сигналинг (Cytokinin signaling —I PINs) → Высокая концентрация ауксина/низкая концентрация цитокинина (High auxin/Low cytokinin) → Морфогенез латеральных корней (Morphogenesis lateral roots).

Инициация образования боковых (латеральных) и придаточных корней, связана с ингибированием цитокининового сигналинга путем индукции супрессоров этого процесса RR7 и RR15 (Response Regulator genes) (схема 2). При этом ингибируется супрессор транспортера ауксина PIN, что ведет к уменьшению содержания цитокинина и увеличению ауксина, локализованного в местах появления латеральных корней (ткани перицикла). Потеря функции RR7 и RR15 ведет к нарушению раннего эмбриогенеза в корневой «stem-cells» системе (Muller, Sheen, 2008).

Возникает вопрос о происхождении цитокинина в клетках симбиотрофного организма – растительного или бактериального (ризобиального). Считают, что это растительный цитокинин, хотя установлена способность фотосинтетических видов Bradyrhizobium, не продуцирующих Nod-фактор, непосредственно влиять на гормональный уровень. Предполагается, что эта бактерия может индуцировать нодуляцию путем снабжения растения интермедиатами для синтеза цитокинина. Бобовое растение Aeschynomene sensitive, инокулированное мутантами Bradyrhizobium, неспособные к синтезу Nod-фактора, не теряет способности к образованию корневых клубеньков (Giraud et al., 2007). Эти генетические модели говорят о двух механизмах инициации органогенеза клубенька: с активацией Nod-фактором и индукцией цитокинином (Oldroyd, 2007). Проникновение Bradyrhizobium ssp в кортикальные клетки корня через трещины в эпидермисе, минуя корневые волоски, может быть важным доказательством в использовании цитокининового сигнала в инициации деления кортикальных клеток и органогенеза клубенька вместо Nod-факторa (Downie, 2007).

Роль гормонов в образовании клубеньков первоначально основывалась на результатах опытов с изменением уровня цитокинина и применением ингибиторов транспорта ауксина в корнях (Cooper, Long, 1994). В дальнейшем опыты с мутантами L. japonicum по рецептору цитокинина LHK1 и мутантами люцерны по его ортологу CRE1 подтвердили необходимость цитокинина для индукции морфогенеза клубенька (Tirichine et at ., 2007).

Цитокининовый сигналинг локализуется во внутренних тканях корня (кортекс, перицикл) и не связан с эпидермисом. Непосредственным результатом цитокининового сигналинга является CRE1-зависимое изменение в полярном транспорте ауксина, который ингибируется ризобиями и очищенным Nod-фактором (Plet et al., 2011). Ингибирование полярного транспорта ауксина, ведущего к низкому уровню ауксина, и ответная реакция в меристеме клубенька ауксин-чувствительного гена GH3 , исходные факторы органогенеза клубенька, которые наблюдаются при обработке зон корня очищенным Nod-фактором или ризобиями (Mathesius et al ., 1998).

Супрессия цитокининового сигналинга через рецептор цитокинина CRE1 снижает количество клубеньков и увеличивает количество латеральных корней (Gonzalez-Rizzo et al., 2006). В то время как при ингибировании ауксинового сигналинга наблюдается обратное - увеличивается количество клубеньков и снижается образование латеральных корней (Kuppusamy et al., 2009; Сhampion et al ., 2015). Так, по данным Сhampion et al. (2015) ингибирование ауксинового сигналинга посредством ауксин-сигнального регулятора (I-3-AA7) при актиноризальном муталистическом симбиозе ведет к увеличению нодуляции и N 2 -фиксации у древесного вида Casuarina glauca , инокулированного почвенной азотфиксирующей бактерией Frankia .

Изучалось влияние ризобиальной инфекции на уровень ИУК и цитокининов (зеатин+зеатинрибозид) в чувствительной к ризобиям зоне корня (0-20 мм) этиолированных проростков гороха (Глянько и др., 2007; Акимова, Соколова, 2012) Показано, что спустя сутки после инокуляции в указанной зоне корня наблюдалось повышение содержания как ИУК, так и цитокининов. Причем активность ферментов, разлагающих ИУК – пероксидазы и ИУК-оксидазы, снижалась. Эти данные можно, вероятно, объяснить длительностью экспериментов (1 сут), когда зачаточные клетки примордия клубенька вступили в активную фазу деления и размножения, что требует для этих процессов повышенных доз ауксина и изменения соотношения между гормонами. Это подтверждается данными, которые показали сильную активацию ауксин-чувствительного гена GH3.1 (Gretchen Hagen3.1) в меристеме зачаточного клубенька (Grunewald et al., 2009). Другие данные (Olah et al., 2005) свидетельствуют о стимуляции очищенным Nod-фактором образования латеральных корней в 1-5дневных опытах с проростками люцерны. В связи с этими данными требуютcя исследования по изучению роли ауксина и цитокинина на различных стадиях развития клубенька относительно начальной стадии - инициации образования примордия клубенька (Timmers, 2008). C другой стороны, имеются данные об участии ауксинового сигналинга также в ризобиальном инфекционном процессе, в частности, в образовании инфекционной нити в корневых волосках (Breakspear et al., 2014).

CONCLUSION

Полученные экспериментальные данные указывают на то, что цитокинин и ауксин ключевые регуляторы в инициации органогенеза клубенька в кортексе корня. Однако в отличие от образования корневой апикальной меристемы или меристемы латерального корня для инициации клубенька необходим высокий уровень цитокинина и низкий ауксина. Модуляция этих гормонов происходит под первоначальным влиянием ризобиальных Nod-факторов, которые активируются на плазмалемме эпидермальных клеток корня рецептор-подобными киназами (RLK). Наблюдаемый после этого каскад реакций, включающий, в частности, активацию сигнальных систем растения, экспрессию симбиотических генов, синтез ранних белков- нодулинов (ENODs) и белков-транскрипционных факторов (NSP1/2), приводит к инфицированию тканей корня ризобиями и образованию симбиотических структур – инфекционных нитей и клубеньков.

Как уже отмечалось, некоторые виды ризобий (например, Bradyrhizobium ) не нуждаются в Nod-факторах для инициации морфогенеза клубеньков, что, по-видимому, свидетельствует о прямом регулировании уровня цитокинина в клетках растения-хозяина (макросимбионта). Однако большинство ризобий используют Nod-фактор как эволюционно закрепленный путь образования симбиотических структур. Не исключено, что координация реакций в эпидермисе и кортексе в течение нодуляции может быть связана с еще не известными сигналами, которые регулируют поток гормонов. В этом плане представляет интерес флавоноиды, локальное накопление которых в корне может изменять баланс гормонов, инициирующих формирование латеральных корней или клубеньков. На различных этапах формирования клубеньковой меристемы концентрация, соотношение и физиологическая роль этих гормонов может, по-видимому, изменяться, что требует дальнейшего изучения.