Участие кофейной кислоты в регуляции физиологических процессов растений картофеля в условиях гипотермии

Вве^ение. Растительный организм обладает уникальной способностью синтезировать вторичные метаболиты. Это низкомолекулярные вещества, которые характеризуются высокой физиологической активностью. Их количество чрезвычайно велико, однако физиолого-биохимическая роль разных групп данных соединений в растительном организме изучена в разной степени [1, 2]. Что касается фенольных соединений, то в основном исследователи уделяют внимание флавоноидам, которые играют ва^ную роль в биохимической адаптации растений, обладая антиоксидантными свойствами [3]. Другие представители фенольных соединений, а именно фенилпропаноиды, изучены в меньшей степени. В последнее время появился ряд работ, касающихся изучения действия препарата «Циркон», синтезированного отечественной фирмой «НЭСТ-М» на основе гидроксикоричных кислот, являющихся представителями фенилпропаноидов [4, 5]. Следует отметить, что для выявления роли гидроксикоричных кислот в реакциях метаболизма ва^но использовать не их смесь, а участие отдельных представителей, так как ка^дый из них имеет особенности в строении и, как следствие, обладает спецификой действия. Так, большинство гидроксикоричных кислот (n- оксикоричная, феруловая, синаповая) в растительном организме находятся в связанном состоянии, тогда как кофейная кислота – в основном, в свободном виде и способна к передви^ению [1]. Показано, что кофейная кислота повышает устойчивость растений к действию биотических факторов: к вирусным инфекциям у плодовых и ягодных культур [6], к мучнистой росе у пшеницы [7], к р^авчинной инфекции у р^и [8]. Лишь в единичных работах отмечается ее роль в устойчивости растений к абиотическим факторам среды [9, 10]. В ряде работ показано действие кофейной кислоты на ростовые реакции органов растений, однако при этом отмечается ее неоднозначный эффект [11].

Цель работы состояла в исследовании действия кофейной кислоты на мембранные процессы (фотохимическую активность изолированных хлоропластов, коэффициент повре^дения мембран), активность антиоксидантной системы и рост растений картофеля в условиях двухчасовой гипотермии (-2°С).

Условия, материалы и мето^ы. Объектом исследования слу^или растения картофеля ( Solanum tuberosum L.) сорта Жуковский ранний селекции ВНИИ КХ (Коренёво, Россия). Растения выращивали в условиях лаборатории «Регуляция роста и развития растений» Орловского госуниверситета. Для получения 21-дневных побегов возобновления клубни картофеля, вышедшие из состояния покоя, переносили из овощехранилища в условия лаборатории, где их проращивали при температуре 20±2°С в контейнерах с вла^ными опилками в начале в темноте, а после появления всходов на поверхности субстрата, при комнатном освещении.

Гипотермию создавали, помещая контейнеры с растениями в низкотемпературный шкаф Т 25/01 (Россия) на 2 часа при температуре -2°С, имитирующей заморозки.

Варианты опыта включали опрыскивание побегов возобновления через 15 суток после появления всходов 0.1 мМ раствором кофейной кислоты (Sigma, СШ^). Контрольные растения опрыскивали водой. Исследования проводили через 7 суток после обработки растений.

Фотохимическую активность изолированных хлоропластов определяли по количеству восстановленного на свету феррицианида калия [12]. Среда выделения хлоропластов содер^ала 0.35 М NaCl и 0.05 М Трис-HCl–буфер (pН 8). Гомогенат фильтровали и два^ды центрифугировали при 2000 и 8000 об/мин. После ресуспендирования 0.035 М NaCl суспензию хлоропластов с 0.002 М К 3 Fe(CN) 6 помещали в бюксы. Часть бюксов выставляли на свет (интенсивность освещения 20000 лк) в специально смонтированную установку с охла^дением (18°С). Часть бюксов помещали в темноту. Экспозиция составляла 10 мин. Реакцию гасили 5% ТХУ. Оптическую плотность измеряли на КФК-3 («ЗОМЗ», Россия) при длине волны 420 нм. Степень пов^е^дени^ мемб^ан определяли по выходу электролитов по методу, описанному [13]. Для этого навеску листьев заливали 10 мл дистиллированной воды и оставляли на 4 часа при комнатной температуре, после чего определяли электропроводность на кондуктометре «Эксперт 002» («Эконикс-Эксперт», Россия). Полный выход электролитов определяли после разрушения мембран кипячением в течении 20 минут. Затем рассчитывали коэффициент повре^дения мембран по формуле (1):

КП = ^{L D L 0} ⋅ 100% , (1) 100 - L ₀

где L D – выход электролитов из ткани листьев растений при действии гипотермии (% от полного выхода электролитов);

L 0 – выход электролитов из тканей растений в оптимальных условиях (% от полного выхода электролитов).

Соде^^ание ма^онового диа^ьдегида определяли по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой при нагревании [14]. Активность супе^оксиддисмутазы определяли по реакции восстановления нитросинего тетразолия, запускаемой рибофлавином [15]. Массу органов измеряли на электронных весах ВСТ (Россия).

На рисунках представлены средние арифметические из 4-5 биологических повторностей и их стандартные ошибки. ^налитическая повторность 3-5-кратная. Достоверность результатов оценивали с помощью критерия Стьюдента, считая достоверными различия при уровне доверительной вероятности выше 0.95.

Результаты и обсу^^ение. Исследование фотохимической активности изолированных хлоропластов выявило некоторое различие в скорости транспорта электронов, сопря^енного с нециклическим фотофосфорилированием в присутствии кофейной кислоты (рис.1). Так, в бесстрессовых условиях кофейная кислота на 11% стимулировала фотохимическую активность хлоропластов. Больший эффект отмечен сразу ^е после действия 2-часовой гипотермии (-2°С). Так, восстановление феррицианида в варианте с кофейной кислотой увеличилось на 37% против контроля.

Рисунок 1 – Действие кофейной кислоты на фотохимическую активность хлоропластов

Возрастание скорости световых реакций фотосинтеза при обогащении растений кофейной кислотой, возмо^но связано с изменением гормонального статуса. В наших предыдущих исследованиях показано, что кофейная кислота повышает уровень ауксинов [16]. Известна поло^ительная роль данной группы фитогормонов в функционировании активных центров фотосистемы II [17]. Не исключено, что эффект кофейной кислоты на фотохимическую активность хлоропластов мо^ет быть связан и с состоянием их мембран. В этой связи было изучено влияние кофейной кислоты на целостность мембран в условиях гипотермии.

Данные рисунка 2 свидетельствуют о том, что кофейная кислота существенно сни^ает коэффициент повре^дения мембран (в 2,5 раза), рассчитанный по утечке электролитов в условиях гипотермии.

• □ Контроль

• ■ Кофейная кислота

  
  
  

Рисунок 2 – Влияние кофейной кислоты на утечку электролитов через мембраны при действии гипотермии

О степени целостности мембран мо^ет свидетельствовать и содер^ание малонового диальдегида – конечного продукта перекисного окисления липидов (рис. 3). Данный показатель увеличился в условиях стресса (в 1,8 раза), однако кофейная кислота сдер^ивала накопление малонового диальдегида как в оптимальных, так и в стрессовых условиях (почти на 25%).

температурные условия

2-часовая гипотермия

Контроль

Кофейная кислота

Рисунок 3 – Действие кофейной кислоты на содер^ание малонового диальдегида

Протекторный эффект кофейной кислоты на состояние мембран возмо^но обусловлен активизацией работы антиоскидантной системы, утилизирующей активные формы кислорода в условиях стресса. Определение активности фермента супероксиддисмутазы (рис. 4) показало усиление нейтрализации супероксидрадикала при обработке кофейной кислотой. Наибольший эффект кофейной кислоты проявился в стрессовых условиях (55% против 22% по сравнению с оптимальными температурными условиями).

Рисунок 4 – Влияние кофейной кислоты на активность супероксиддисмутазы

Кофейная кислота оказала неоднозначное действие на ростовые показатели побегов возобновления картофеля через 10 суток после действия 2часового стресса (рис.5).

(а)

Кофейная кислота

Контроль

системы

Рисунок 5 – Действие кофейной кислоты на ростовые показатели растений через 10 суток после действия гипотермии: ( а) высота побега; (б) сырая масса

Так, высота растений не изменилась. Возмо^но, это связано с тем, что в оптимальных условиях кофейная кислота не влияла на уровень гиббереллинов, ответственных за регуляцию роста растений в высоту [18]. Что касается массы растения, то выявлено ее увеличение почти на 30% по сравнению с контролем. Одновременно надо отметить, что в 1,8 раза увеличилась масса придаточных корней побегов возобновления.

Выво^ы . Полученные результаты показали, что кофейная кислота – представитель гидроксикоричных кислот, в условиях 2-часовой гипотермии (-2°С) сохраняет поло^ительный эффект бесстрессовых условий на фотохимическую активность изолированных хлоропластов как за счет уменьшения деградации мембран, так и активизации работы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы, что в конечном итоге поло^ительно сказалось на массе растений.