Участие опиоидных рецепторов в реализации кардиопротекторного эффекта хронической нормобарической гипоксии

Ранее нами было показано, что опиоидная система играет важную роль в реализации кардиопротекторного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии [ 3 ]. Однако до настоящего времени остаются неисследованными рецепторная специфичность этого феномена и локализация опиоидных рецепторов (ОР), принимающих участие в реализации кардиопротектор-ного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии.

Цель исследования: изучение локализации опиоидных рецепторов, обеспечивающих кардиопротекторный эффект адаптации к хронической нормобарической гипоксии, и оценка рецепторной специфичности этого феномена.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Вистар массой 250–300 г. Животных подвергали адаптации к хронической нормобарической гипоксии, помещая их на 21 день в камеру при нормальном атмосферном давлении. Содержание O2во вдыхаемом воздухе поддерживали в пределах 11,75–12,25%, а концентрацию CO2 – на уровне 0,03% [13, 16]. Указанную атмосферу в камере создавали с помощью прибора “Био-нова-204G4R1” (НТО Био-нова, Москва, Россия). Давление O2 и CO2 внутри камеры постоянно контролировали датчиками TCOD-IR и ОLC 20 (Oldham, Франция) через блок управления MX32 (Oldham, Франция).

Ишемию миокарда (20 мин) моделировали путем перевязки левой коронарной артерии у животных, наркотизированных с помощью пентобарбитала натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно, Sanofi-Aventis, Франция). Продолжительность последующей реперфузии составила 180 мин [16]. Во время выполнения процедуры крысы находились на искусственной вентиляции, которую осуществляли с помощью модифицированного аппарата “РО-6” (ОАО “Красногвардеец”, Санкт-Петербург, Россия).

После ишемии и реперфузии сердце выделяли и промывали физиологическим раствором через канюлированную аорту. Для определения размера зоны гипоперфузии (зона риска – ЗР) проводили окраску сердца насыщенным раствором перманганата калия через аорту, правый желудочек удаляли и взвешивали. Срезы толщиной в 1 мм производили перпендикулярно продольной оси сердца [16]. Для определения зоны некроза (ЗН) срезы окрашивали 1%-м раствором 2,3,5-трифенил тетразо-лия хлорида (30 мин, 37 °C) и на 1 сутки помещали в 10%-й раствор формальдегида. На следующий день после окрашивания срезы сканировали с обеих сторон (сканер HP Scanjet G2710). ЗР и размер некроза определяли компьютеризированным планиметрическим методом. Величина очага инфаркта (ЗН) была выражена в процентах от области гипоперфузии. Во избежание погрешностей, связанных с сезонным изменением чувствительности сердца к действию ишемии-реперфузии, контрольные опыты проводили параллельно с каждой серией экспериментов.

Адаптированным животным перед моделированием коронароокклюзии внутривенно вводили один из следующих препаратов:

– физиологический раствор (адаптационный контроль);

– налоксона метиодид – блокатор всех субтипов опиоидных рецепторов, не проникающий через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), в дозе 5 мг/кг за 25 мин до ишемии [14];

– TIPP(ψ) (H-Tyr-TicPψ-[CH2NH]-Phe-Phe-OH) – блокатор δ-рецепторов в дозе 0,5 мг/кг за 25 мин до коро-нароокклюзии [2];

– BNTX (Benzylidenenaltrexone maleate) – блокатор δ1-рецепторов в дозе 0,7 мг/кг за 25 мин до коронароок-клюзии [14];

– налтрибен – блокатор δ2-рецепторов в дозе 0,3 мг/кг за 25 мин до коронароокклюзии [14].

Налтрибен и BNTX предварительно растворяли в 0,1 мл DMSO, а затем в 1 мл в 20%-м растворе hydroxypropyl- β -cyclodextrin, остальные субстанции – в 0,9%-м растворе NaCl.

Все вышеназванные препараты вводили в объеме 0,2 мл.

Ранее нами было показано, что у неадаптированных крыс блокаторы опиоидных рецепторов в использованных дозах не влияют на соотношение “ЗН/ЗР” [14].

Выделение изолированных кардиомиоцитов из сердца крысы проводили энзиматическим методом [5], для чего у анестезированных пентобарбиталом (60 мг/кг) и гепаринизированных (5000 МЕ/кг) крыс проводили шейную дислокацию и стернотомию. После этого сердца быстро иссекали и помещали до исчезновения сокращений в буферный раствор Тирода (+4о) следующего состава (в мМ): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1 Na2HPO4, 1 MgCl2.6H2O, 10 глюкозы, 5 HEPES с добавлением 1,6 г/л бычьего сывороточного альбумина (БСА). Аорту канюлировали и закрепляли для ретроградной перфузии. Скорость перфузии на протяжении всего выделения (25–30 мин) составляла 10 мл/мин, температура раствора – 37 °С, рН=7,4. Все растворы были предварительно насыщены смесью газов: 95% O2 – 5% CO2. Для выделения кардиомиоцитов буфер Тирода добавляли коллагеназу Yakult (600000 ЕД/ л) и протеазу тип XIV (0,230 г/л) и продолжали перфузию в течение 7–12 мин. Затем в течение 4 мин миокард перфузировали раствором Тирода, не содержащим ферменты, после чего сердце отсекали от аорты, выделяли левый желудочек и диспергировали его в 5 мл буфера Тирода, содержащего 10 г/л БСА. Для стабилизации выделенные клетки культивировали в течение 1 ч в СО2-ин-кубаторе (Sanyo, Япония) при температуре +28 °С и 5%-м содержании СО2. Для имитации ишемии в течение 25 мин выполняли метаболическое ингибирование аэробного дыхания с помощью буфера, содержащего (в мМ): 118 NaCl, 25 NaHCO3 4,7 KCl, 1,2 MgSo4, 1,2 KH2PO4,20,0 2-де-зоксиглюкозы, 1,,5 NaCN, без аэрирования при рН=7,4. Контролем служили клетки, ресуспендированные в бескальциевом растворе Кребса, содержащем (в мМ): 118 NaCl, 25 NaHCO3 11 Glucose, 4,7 KCl, 1,2 MgSo4 1,2 KH2PO4, при рН=7,4. Посл, е окончания времени метаб,олического ингибирования надосадочную суспензию клеток тщательно собирали, помещали в буфер Тирода и оставляли на 30 мин, имитируя тем самым реперфузию. По окончании такой “реперфузии” контроль выживаемости клеток проводили микроскопически по включению красителя трипанового синего. Для этого к 100 мкл суспензии кардиомиоцитов добавляли 10 мкл трипанового синего, подсчитывали процент погибших (окрашенных в синий цвет) и выживших (не окрашенных трипановым синим) кардиомиоцитов. Гибель клеток при ишемии-реперфузии вычисляли в процентах от контроля (инкубирование с буфером Кребса).

Ингибиторы опиоидных рецепторов добавляли в инкубационную среду изолированных кардиомиоцитов за 25 мин до моделирования ишемии:

– ингибитор всех типов ОР – налтрексон – в концентрации 1 µM [9];

– ингибитор µ-ОР – CTAP – в концентрации 1 µM [7];

– ингибитор δ-ОР – TiPP (ψ) – в концентрации 0,1 µM [15];

– ингибитор δ2-ОР – налтрибен – в концентрации 10 µM [18].

Статистическую обработку результатов производили, используя программу STATISTICA 6.0 с помощью t-критерия Стьюдента для нормально распределенных величин и критерия Манна–Уитни для распределений, отличающихся от нормального. Результаты выражали как среднее арифметическое (М)±стандартная ошибка средней (SEM).

Результаты и обсуждение

Исследования показали (табл. 1), что ЗН у неадаптированных крыс составляет около 56% от зоны гипоперфузии, а у крыс, адаптированных к хронической гипоксии, – 20,4% от ЗР, что достоверно ниже чем в группе животных, не подвергшихся адаптации (р<0,01). Это свидетельствует о том, что адаптация к хронической нормобарической гипоксии оказывает выраженный кардио-протекторный эффект.

Предварительная блокада периферических ОР у адаптированных животных с помощью налоксона метиодида способствовала увеличению размеров ЗН с 21,1 до 46,5%, что было близко к контрольным значениям. Следователь- но, кардиопротекторный эффект адаптации к хронической нормобарической гипоксии опосредуется через активацию периферических ОР.

Как следует из указанной таблицы, блокада d-ОР селективным антагонистом TIPP(ψ) у адаптированных животных приводила к увеличению индекса ЗН/ЗР более чем на 30% по отношению к таковым показателям в группе адаптационного контроля. В результате соотношение “зона некроза/зона риска” оказалось равным таковому в контрольной группе неадаптированных крыс. Эти данные указывают на то, что δ-ОР принимают участие в формировании кардиопротекторного эффекта адаптации к гипоксии. Известно, что δ-ОР подразделяются на два субтипа: δ1-ОР и δ2-ОР [8]. На фоне блокады δ1-ОР селективным антагонистом BNTX размер ЗН, относительно показаний у адаптированных животных, не изменялся, то есть защитный эффект адаптации к хронической гипоксии сохранялся. “Выключение” δ2-ОР селективным блокатором налтрибеном у животных, подвергшихся адаптации, приводило к увеличению индекса ЗН/ЗР с 20,4 до 54,9%, и этот показатель терял достоверные отличия от группы неадаптированного контроля.

Полученные данные позволяют аргументировать то, что в кардиопротекторном эффекте адаптации к хронической нормобарической гипоксии важную роль играют δ2-ОР.

Предварительная блокада µ-ОР их селективным блокатором СТАР приводила к устранению кардиопротектор-ного эффекта адаптации, на что указывает увеличение размера инфаркта миокарда (ЗН/ЗР) до контрольных значений.

Результаты исследований in vivo были подтверждены в опытах на изолированных кардиомиоцитах (табл. 2). В ходе экспериментов было показано, что ишемия вызывает гибель 15,1±0,6% клеток, выделенных из миокарда неадаптированных крыс. Напротив, число погибших кардиомиоцитов, выделенных из миокарда адаптированных к хронической гипоксии крыс, составило после ишемии лишь 6,7±0,7%. Эти данные опять-таки говорят в пользу защитного эффекта хронической гипоксии.

При добавлении налтрексона – блокатора всех типов ОР – в инкубационную среду “ишемизированных” кардиомиоцитов адаптированных крыс мы наблюдали гибель 11,1±1% клеток, что достоверно не отличалось от

Таблица 1

Влияние блокады опиоидных рецепторов на размер зоны некроза при 20-минутной коронароокклюзии и 180-минутной реперфузии у крыс после курса адаптации к непрерывной нормобарической гипоксии (M±SEM)

Группы	n	МПЖ, мг	МЛЖ, мг	Зона риска, мг	Зона некроза, мг	ЗН/ЗР (%)
Контроль (неадаптированные крысы)	15	207±15,0	861,9±44,9	337,5±27,6	142,3±21,2	56,5±2,9
Адаптация к гипоксии	18	256,1±12,8 Р<0,05	760,5±28,2	360,4±23,6	142,9±23,5	20,4±1,7 р<0,01
Адаптация + налоксона метиодид (5 мг/кг)	12	478±36,8	1021,2±46,8	205,5±43,6	429,4±22,6	46,5±6,95 р1<0,01
Адаптация + TIPP ( ψ ) (0,5 мг/кг)	13	293,2±12,6	831,4±32,8	372,9±17,5	209,1±13,8	56,1±4,1 р1<0,01
Адаптация + налтрибен (0,3 мг/кг)	11	275,3±7,1	885,5±37,4	266,4±24,3	146,6±18,4	54,9±4,1 р1<0,01
Адаптация + BNTX (0,7 мг/кг)	11	276,6±7,8 Р1<0,01	848,4±24,2	293±33,6	34,4±5,9	13,6±3,07 Р1<0,01
Адаптация + CTAP (0,1 мг/кг)	12	307,5±8,8	896,8±33,7	369,6±32,5	181,7±36,9	49±9,3 р1<0,01

Примечание: МПЖ — масса правого желудочка, МЛЖ — масса левого желудочка, ЗН/ЗР — соотношение массы зоны некроза к массе зоны риска , р — уровень достоверности относительно группы контроля, р1 – уровень достоверности относительно группы адаптированных животных.

значений, характерных для неадаптированных крыс. Иными словами, защитного эффекта адаптации к гипоксии в этом случае мы не наблюдали, что говорит о зависимости кардиопротекторного эффекта адаптации к гипоксии от активации опиоидных рецепторов.

При селективном ингибировании µ-ОР с помощью СТАР реоксигенационная гибель кардиомиоцитов адаптированных крыс составила 10,34±2,1%, при избирательной блокаде δ-ОР этот показатель оказался равным 9,52±1%, а ингибирование δ2-ОР налтрибеном приводило к увеличению гибели изолированных кардиомиоцитов адаптированных крыс в количестве 10,67±0,9% от общего числа клеток в суспензии. Следовательно, мы наблюдали отсутствие кардиопротекторного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии при селективном ингибировании δ2- и µ-опиоидных рецепторов.

Таким образом, результаты опытов на изолированных кардиомиоцитах подтверждают данные, полученные на модели острой коронароокклюзии и последующей реперфузии.

Кардиопротекторный эффект активации опиоидных рецепторов был известен и ранее. Так, в опытах с 45-минутной коронароокклюзией и 2-часовой реперфузией миокарда крыс нами было показано, что активация δ2-опиоидных рецепторов их селективным агонистом дель-торфином II приводит к уменьшению показателя ЗИ/ОР. Инфаркт-лимитирующий эффект дельторфина II, как правило, сохраняется после инъекции антагониста δ1-ОР BNTX, но не проявляется после блокады δ2-ОР налтрибе-ном [14]. При этом нам так и не удалось выявить инфаркт-лимитирующий эффект дельторфина II после блокады периферических ОР метиодидом налоксона (5 мг/кг). Следовательно, повышение толерантности сердца к действию ишемии-реперфузии под действием дельторфина II может быть следствием активации периферических δ2-ОР. Эти данные полностью согласуются с результатами настоящей работы, которые свидетельствуют о важной роли δ2-ОР в формировании защитного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии.

В литературе отсутствуют данные об инфаркт-лими-тирующем эффекте селективных агонистов µ-ОР. В то же время наши данные свидетельствуют о том, что эндогенные агонисты µ-ОР могут обеспечивать повышение толерантности сердца к действию ишемии-реперфузии. Возможно, что эндогенные и экзогенные µ-агонисты ак-

Таблица 2

Гибель кардиомиоцитов после 30-минутного метаболического ингибирования и последующей 30-минутной реоксигенации

Группы	Контроль (n=8) %	Хроническая гипоксия (n=10) %
Ишемия-реперфузия	15,17±6,41	6,69±0,69 p=0,017391
Налтрексон 1 µ M	11,84±5,10	11,10±6,2
CTAP 1 µ M	12,28±6,38	10,34±5,79
TiPP ( ψ ) 0,1 µ M	11,98±0,74	9,52±0,89
Налтрибен 10 µ M	10,47±5,94	10,67±3,77

Примечание: p – уровень достоверности относительно группы контроля.

тивируют различные субтипы µ-ОР, одни из которых не влияют на устойчивость сердца к действию ишемии и реперфузии, активация же другого субтипа µ-ОР создает повышенную толерантность кардиомиоцитов к действию гипоксии-реоксигенации.

Следующий раздел нашей работы был посвящен изучению вопроса о внутрисердечной или экстракардиаль-ной локализации периферических опиоидных рецепторов, отвечающих за кардиопротекторный эффект хронической гипоксии.

Известно, что на сарколемме кардиомиоцитов находятся δ- и µ-опиоидные рецепторы [11, 12]. Полученные нами ранее данные говорят о том, что при адаптации животных к хроническому стрессу в крови увеличивается содержание β -эндорфина и стресс-гормонов [4]. Установлено также, что опиоидные пептиды (такие как в-эн-дорфин, мет-энкефалин) могут синтезироваться в ткани миокарда из высокомолекулярных предшественников [6, 10]. Следовательно, можно предположить, что в условиях адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии опиоидные пептиды могут активировать опиоидные рецепторы, расположенные на мембранах кардиомиоцитов. Наши эксперименты с изолированными клетками сердца свидетельствуют о том, что µ- и δ₂-опиоидные рецепторы, принимающие участие в реализации протекторного эффекта адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии, расположены в кардиомиоцитах. Это согласуется с данными об участии δ-ОР в реализации кардиопротекторного эффекта ишемического прекондиционирования и адаптации к гипобарической гипоксии [1, 2, 17]. Американские физиологи обнаружили, что в механизме кардиопротектор-ного эффекта ишемического прекондиционирования важную роль играют δ₁-ОР [17], тогда как наши опыты показали, что к исчезновению кардиопротекторного эффекта адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии приводит селективная блокада не δ₁-ОР, а δ₂-ОР. Этот факт говорит о том, что инфаркт-лими-тирующий эффект адаптации к гипоксии связан именно с активацией δ₂-ОР. Кроме того, наши данные указывают на то, что кардиальные µ-ОР также принимают участие в реализации кардиопротекторного эффекта адаптации к непрерывной гипоксии.

Заключение

Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о том, что кардиопротекторный эффект адаптации к непрерывной нормобарической гипоксии связан с активацией кардиальных δ2- и µ-ОР. Следовательно, селективная стимуляция этих рецепторов в перспективе может быть использована для профилактики ишемических и реперфузионных повреждений сердца.