Участие слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз в устойчивости к кольцевой гнили у диких мексиканских видов и культурных сортов картофеля

По данным на 1989 год, представленным Х. Россом (1), средний ежегодный ущерб от бактериальных болезней картофеля в мире составляет более 20 % на фоне дефицита устойчивых сортов. Для селекции дикорастущие виды картофеля, обладающие высокой адаптивной способностью, — основный генетический источником устойчивости к патогенам (2) и неблагоприятным факторам среды.

Многие авторы отмечают (3), что в качестве маркера устойчивости можно использовать активность ферментов прооксидантной и антиоксидантной системы растительных клеток: каталазы, НАДФН-оксидазы и особенно пероксидазы, которая обладает широким спектром действия и часто встречается в природе (4-11). Физиологическая роль пероксидазы в растительной клетке очень важна, в связи с чем функции отдельных изоформ фермента в значительной мере разнятся. Пероксидазы, выделенные из одного и того же растения, могут иметь неодинаковую молекулярную массу и субстратную специфичность (12). Пероксидаза найдена во всех ком-партментах растительной клетки, и для этого фермента отмечают видовую, органогенную, тканевую и внутриклеточную специфичность распределения изоформ (13).

Особое внимание уделяется изменению активности фермента во взаимодействиях патогена и растения. Известно, что пероксидазная активность может многократно повышаться в инфицированных патогеном растениях, причем наиболее существенно — у форм фермента, связанных с клеточной стенкой (14).

Мы сравнили биохимические свойства слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз и устойчивость при заражении бактериальным патогеном у диких и культурных форм картофеля.

Методика . В работе использовали растения картофеля in vitro, пре-

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 10-04-00921-а, междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН-2006 № 45.

доставленные Институтом картофелеводства НАН Беларуси (у ди- и тет-раплоидного картофеля признак устойчивости передается соматическим гибридам): Solanum bulbocastanum (геном ВВ или A^piA^pi), S . cardiophyllum (диплоид, ВВ), S . polyadenium (геном ВВ или A^po1A^po1) (15), а также культурные сорта Луговской, Лукьяновский (получены из Всероссийского НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха — ВНИИКХ, Московская обл.). Растения выращивали из черенков на агаризованной среде МС с добавлением гормонов и витаминов (16). Возбудитель кольцевой гнили — штамм 5369 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck. Et Kott.) Skapt et Burkh был получен из ВНИИКХ. Бактерии культивировали на картофельном агаре с глюкозой (1,5 % в конечной концентрации).

Растения картофеля выращивали in vitro в течение 10 сут в климатической камере с контролируемым режимом, затем помещали на среду МС без агара (рН 5,8), куда вносили по 1 мл бактериальной суспензии (2x108 кл/мл). В контроль добавляли 1 мл стерильной культуральной среды для бактерий. Прирост длины стебля и состояние растений по признакам пожелтения (хлороза) и усыхания листовых пластинок оценивали каждые 3 сут в течение 12 сут. Принятая шкала оценки устойчивости: 4 балла — устойчивые (более 100 %), 3 — среднеустойчивые (85-100 %); 2 — слабоустойчивые (70-84 %); 1 — неустойчивые (менее 70 %). Один вариант опыта включал 6 повторностей, опыты проводили трижды.

Слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы выделяли из корневых, стеблевых и листовых тканей. Навески тканей (1 г) помещали в шприц, добавляли 2 мл холодного цитратно-фосфатного буфера (0,1 М, рН 6,2) и дважды подвергали действию обратного давления в течение 1 мин. Гомогенат центрифугировали и в супернатанте оценивали активность фермента (17). Для определения величины рН, оптимальной для активности фермента, концентрации цитратно-фосфатного буфера варьировали от рН 4,0 до рН 7,0 с шагом 0,2.

Электрофорез нативного белка проводили в блоках полиакриламидного геля (18). Для выявления ферментативной активности в геле использовали диаминобензидиновый метод (19).

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием компьютерных программ StatSoft (Statistica v. 6.0).

Резуёътаты . Как показали наблюдения, у растений in vitro в присутствии патогена выраженными симптомами заболевания были угнетение роста и развивающийся хлороз листовых пластинок, приводящий к усыханию всего растения. По этим признакам дикие типы и сорта картофеля располагались в порядке, представленном в таблице 1.

1. Устойчивость к Clavibacter michiganensis (штамм 5369) у диких видов и сортов картофеля после 12 сут культивирования in vitro ( X ± х )

Дикий вид, сорт На растение Устойчивость доля неповрежденных листьев, % (А) средняя длина стебля относительно контроля, % (Б) (А + Б)/2 балл Solanum bulbocastanum              98±2                         120±2                 109,0     4 S. cardiophyllum                     97±1                           122±2                   109,5      4 S. polyadenium                     99±2                         119±2                 109,0     4 Луговской                       96±2                       118±2                107,0     4 Лукьяновский__________ 56±2                        70±2                 63,0     1 Примечание. Приведены средние арифметические из 3 опытов, каждый из которых состоял из 6 повторностей. Статистическую обработку проводили по относительным величинам, выраженным в процен- тах. В контроле растения с хлорозами отсутствовали. Условный показатель устойчивости выражали через суммы средних величин длины стебля относительно контроля и доли неповрежденных (без хлороза) листовых пластинок. Баллы: 4 — устойчивые (более 100 %); 3 — среднеустойчивые (85-100 %); 2 — слабоустойчивые (70-84 %); 1 — неустойчивые (менее 70 %).

Наиболее устойчивыми к бактериозу оказались дикие виды и сорт картофеля Луговской, наименее устойчивым — сорт Лукьяновский. Корреляция между приростом стеблей и хлорозом листьев была высокой ( r = - 0,80±0,11). В экспериментах, проводимых в разное время, у одних и тех же диких видов и сортов наблюдались некоторые вариации в степени устойчивости к патогену, хотя общая тенденция в пределах условно принятой нами 4-балльной шкалы сохранялась (см. табл. 1).

Как известно, у пероксидазы в зависимости от объекта, из которого она выделена, и природы субстрата реакции различаются значения рН, оптимальные для проявления ее активности. Вероятно, локальные изменения рН в клетке регулируют вовлечение тех или иных изоферментов в процесс окисления фенольных соединений, оправдывая существование множественных форм пероксидазы (20).

2. Активность (усл. ед/г сырой массы) слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы у диких видов и сортов картофеля при заражении Clavibacter michiganensis (штамм 5369) in vitro ( X ± х )

Показатель	Контроль (интактные растения)		Опыт (зараженные растения)
	лист	стебель | корень	лист I	стебель	корень
		Дикие виды Solanum bulbocastanum
Оптимум рН	4,4	4,6           6,0	4,4	4,6	6,2
Активность пероксидазы	1,410±0,053	1,590±0,055 2,990±0,207 S. cardiophyllum	3,420±0,270	3,490±0,230	6,250±0,330
Оптимум рН	6,0	6,0           6,0	4,8	4,8; 5,4	6,6
Активность пероксидазы	1,903±0,140	1,920±0,180 2,003±0,130 S . polyadenium	3,250±0,110	4,040±0,280	6,228±0,640
Оптимум рН	5,8	5,2           6,4	4,8	5,6	6,4
Активность пероксидазы	1,740±0,006	1,380±0,210 2,490±0,430 Сорта Луговской	2,530±0,060	4,460±0,280	6,730±0,420
Оптимум рН	4,8	6,2           6,2	6,0	6,4	5,6
Активность пероксидазы	1,367±0,073	1,570±0,020 1,952±0,011 Лукьяновский	3,313±0,025	2,360±0,044	2,841±0,054
Оптимум рН	4,4	4,4           5,0	6,0	4,2	4,6
Активность пероксидазы	0,814±0,009	0,696±0,007 0,614±0,019	1,405±0,143	0,979±0,012	1,11±0,015
Примечание. Приведены средние вторностей.		арифметические из 3 опытов, каждый из		которых состоял из 6 по-

Полученные данные об изменении рН-оптимума активности пероксидазы в разных тканях (табл. 2) могут отражать особенности организации активного центра у формы, слабо связанной с клеточной стенкой. Существует мнение, что рН-зависимость активности обусловлена наложением двух рН-зависимостей — собственно реакции превращения субстрата и конформационных изменений глобулы фермента (21). В случае пероксидаз существуют стандартные условия измерения активности, зависящие от природы выбранного субстрата, или определения оптимального значения, при котором активность фермента будет иметь наиболее высокое значение.

Изоферментный полиморфизм как выражение генетического разнообразия установлен для пероксидаз многих растительных организмов и представляет собой лишь частный случай белкового полиморфизма, возникшего и закрепившегося в процессе эволюции видов (20, 22). При патогенезе пероксидазы клеточной стенки первыми контактируют с возбудителями и способствуют видоизменениям последней и включению внутриклеточных механизмов адаптации. Поэтому было необходимо изучить и сравнить молекулярные формы слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенные из тканей исследуемых растений картофеля (табл. 3).

3. Относительная электрофоретическая подвижность (R f ) изоформ слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы у диких видов и сортов картофеля при заражении Clavibacter michiganensis (штамм 5369) in vitro

Орган	|    Контроль (интактные растения)	|     Опыт (зараженные растения)
	Дикие виды
	Solanum bulbocastanum
Лист	0,05; 0,37; 0,59; 0,66	0,05; 0,37; 0,59; 0,66
Стебель	0,37	0,37
Корень	0,05; 0,13; 0,17; 0,37; 0,53; 0,63; 0,72	0,05; 0,13; 0,17; 0,37; 0,53; 0,63; 0,72
	S . cardiophyllum
Лист	0,05; 0,15; 0,32; 0,39; 0,44; 0,49; 0,59	0,05; 0,15; 0,32; 0,39; 0,44; 0,49; 0,59
Стебель	0,36; 0,44; 0,61	0,36; 0,44; 0,61
Корень	0,05; 0,15; 0,32; 0,42; 0,52; 0,61; 0,70; 0,79	0,05; 0,15; 0,32; 0,42; 0,52; 0,61; 0,70; 0,79
	S . polyadenium
Лист	0,08; 0,44; 0,56; 0,60; 0,66	0,08; 0,44; 0,56; 0,60; 0,66
Стебель	0,06; 0,11; 0,44; 0,52	0,06; 0,11; 0,44; 0,52
Корень	0,06; 0,11; 0,40; 0,51; 0,55; 0,60; 0,68	0,06; 0,11; 0,40; 0,51; 0,55; 0,60; 0,68
	Сорта
	Луговской
Лист	0,61; 0,75; 0,83	0,61; 0,75; 0,83
Стебель	0,47; 0,61; 0,75; 0,83	0,47; 0,61; 0,75; 0,83
Корень	0,47; 0,61; 0,75; 0,83	0,47; 0,61; 0,75; 0,83
	Лукьяновский
Лист	0,61; 0,67; 0,75; 0,83	0,11; 0,27; 0,53; 0,67; 0,75; 0,83; 0,86
Стебель	0,67; 0,75; 0,83	0,67; 0,75; 0,83
Корень	0,67; 0,75; 0,83	0,53; 0,67; 0,75; 0,83

Данные, представленные в таблице 3, показывают, что число молекулярных форм в тканях контрольных и зараженных растений диких видов и сорта картофеля Луговской не изменяется. У восприимчивого сорта Лукьяновский при бактериальном заражении в тканях листьев отмечали появление трех новых молекулярных форм с R f 0,11; 0,27; 0,86, в тканях корня — одной формы с R f 0,53 (см. табл. 3).

Заражение патогеном вызывало увеличение активности исследуемого фермента в тканях у диких видов и устойчивого сорта Луговской, но при этом не происходило синтеза новых молекулярных форм. Количественные соотношения присутствующего в клетке растения ферментного белка не могут изменяться в широких пределах, так как для этого необходима экспрессия нескольких или одного соответствующего гена (23). Как следствие, в случае заражения патогеном большую роль должны играть конформационные преобразования молекулы в целом или изменение ее активного центра. Полученные нами данные свидетельствуют, что повышение активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в тканях зараженных растений у диких видов и сорта Луговской не было обусловлено синтезом фермента de novo. Вероятно, происходило изменение активного центра и пространственной структуры фермента за счет отщепления фрагментов или разрыва слабых связей.

Таким образом, устойчивость диких видов картофеля и сорта Луговской при заражении бактериальным патогеном in vitro в значительной степени зависит от активности слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз. Действие возбудителя кольцевой гнили приводит к активации пероксидазы и влияет на спектр изоформ фермента. Степень увеличения активности сортоспецифична. Наибольшей активностью обладают эти энзимы у устойчивых сортов и диких видов картофеля.