УФ-индуцированный дрожжевой продуцент липазы с широкой субстратной специфичностью - селекция, свойства и получение ферментного препарата

Липазы, изменяющие количественные и/или качественные характеристики жиросодержащего сырья, широко применяются при решении разнообразных задач в современной пищевой и агропромышленной отраслях. Для обеспечения растущих потребностей в препаратах этих ферментов необходимы высокоэффективные продуценты, особенно проявляющие множественную активность в отношении жиров различного состава и происхождения. Цель работы заключалась в поиске нового высокоактивного дрожжевого продуцента липазы с широкой субстратной специфичностью и оптимизация условий его культивирования. Также в настоящем исследовании получен ферментный препарат, обеспечивающий высокую степень гидролиза различных масел, и охарактеризованы его технологические свойства. У 110 изолятов дрожжевых культур, выделенных из природных источников и полученных из коллекций ФГБОУ ВО МГУПП и ФГБУ ГосНИИгенетика, были изучены липолитические свойства. Качественное определение липазной активности осуществляли на дифференциальной питательной среде с трибутирином и красителем метиловым красным, количественное - в соответствии с модифицированным методом Y. Ota и K. Yamada при pH реакционной смеси 5,5. Из 23 штаммов, обладавших липолитической активностью (ЛА), 12 имели достаточно высокие показатели ЛА - от 2,5 до 7,5 Ед/см3. Из них выбрали изолят М10 с максимальной ЛА. Были изучены морфологические, культуральные и физиолого-биохимические особенности штаммов и выполнена молекулярно-генетическая идентификация высокоактивного изолята. С помощью филогенетического анализа штамм был идентифицирован как C andida parapsilosis (степень гомологии 99 %) и депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ ФГБУ ГосНИИгенетика) под номером Y-4055. После проведения УФ-мутагенеза получен высокоактивный мутант C. parapsilosis М10-10, и с применением методов математического планирования подобран состав питательной среды (ПС), оптимальный для культивирования продуцента и биосинтеза фермента (%): горчичное масло - 2,6; дрожжевой экстракт - 1,8; соевая мука - 1; глюкоза - 0,5; Tween 80 - 0,42; СаСО3 - 0,3; КН2РО4 - 0,03; MgSO4 · 7H2O - 0,02. Установлено, что при использовании посевного материала М10-10 в количестве 5 % от объема ПС липаза достигает наибольшей активности в культуральной жидкости к 48 ч ферментации. При глубинном культивировании штамма М10-10 при температуре 30-40 °С и рН питательной среды 5,5-6,5 получен ферментный препарат (ФП) липазы штамма М10-10 со степенью очистки Г20×, ЛА которого составила 30630 Ед/г. Определены оптимальные условия для действия ФП: температура 37 °С и рН 5,5. По активности полученный ФП не уступает коммерческим отечественными и зарубежными аналогам, в том числе препарату Novozym 435 («Sigma-Aldrich», США), имеющему ЛА 24020 Ед/г. Жирнокислотную специфичность препарата липазы определяли при ферментолизе различных растительных масел и анализе липидных продуктов методом газожидкостной хроматографии на хроматографе ShimadzuGC 2010 («Shimadzu», Япония). Модификация растительных масел ферментным препаратом липазы М10-10 Г20× в эмульсии масло/вода позволила достоверно снизить относительное содержание насыщенных жирных кислот (в том числе пальмитиновой и стеариновой) в 2,4; 4,6; 2,9 и 1,5 раза и увеличить относительное содержание полиненасыщенных жирных кислот (в том числе w-3 линоленовой и w-6 линолевой) в 1,5; 1,6; 1,1 и 12 раз соответственно для оливкового, горчичного, подсолнечного и кокосового масел.